Cell 重磅！今年 3 月复旦大学团队在 Cell 发表研究成果，团队利用单细胞测序技术对 143 名患者的 225 个癌症样本进行转录组分析，阐明肿瘤内浸润免疫细胞的异质性，进而鉴定出一群 HLA-DR+CD74+ 中性粒细胞亚群。通过单细胞代谢通路分析、小规模代谢物体外筛选等揭示了基于中性粒细胞的治疗潜力，也为癌症联合疗法的开发提供理论基础[1]。
单细胞测序研究能够描绘组织内细胞图谱及异质性、发掘样本中的少数/稀有细胞群体、鉴定同一细胞类型的不同状态和功能亚型，对机制探究、关键分子的确定和疾病的诊疗具有重要意义。
那如何根据实验需求和表型，正确设计单细胞实验（如分组设置、样本制备流程及注意事项、测序方案等）？数据分析流程及分析思路有哪些（如细胞亚群的注释、差异基因分析、细胞发育/分化轨迹、细胞间互作等）？如何进行个性化数据挖掘，发现关键因子并进行验证？
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一
在设计实验时哪些问题值得考虑？
1. 样本类型的选择要点（细胞或细胞核）
2. 样品制备流程
3. 样品制备注意事项
1）避免污染：取材准确，避免非目标组织的污染，尤其血管丰富组织，尽可能去除红细胞等（如剪碎组织前充分清洗血液；裂红处理）；避免样本制备过程中，所用器械/试剂等对组织/细胞的污染损伤。
2）保证细胞活性和数量：样本质量对数据分析至关重要，但样本制备时细胞粘稠、数量少、活性低的问题经常出现。
① 细胞活性：单细胞测序一般要求细胞活性保证 80% 以上，因此在酶消化法处理组织时，控制酶的浓度和时间，防止消化过度；物理方法解离组织时，避免操作用力过大等机械损伤。
② 细胞数量：细胞活性影响细胞数量，在保证细胞活性的情况下，可增加组织量以获得目标量细胞。
③ 细胞悬液粘稠：组织中杂质干扰或细胞裂解释放的 DNA 会引起细胞粘连，因此操作时应提前充分清洗组织，尽量降低细胞损伤，同时加入 DNA 酶 I 或透明质酸酶以去除粘连。
二
数据分析思路/方向
1. 基础分析包括数据过滤/标准化、高度可变基因选择、数据降维、聚类和细胞类型标注。
2. 个性化分析如细胞谱图绘制（用于揭示稀有细胞或细胞亚型）；细胞状态轨迹分析（了解细胞发育/分化过程以及不同细胞间的转换）；网络互作分析（探究细胞间相互作用以及基因-基因关系网络）；基因集变异分析及转录因子预测等。
三
单细胞研究热门方向
1. 肿瘤领域热点：探究肿瘤微环境免疫细胞的浸润、微环境异质性；癌症分型及分子标志物鉴定；癌症机制解析。
2. 免疫领域热点：解析免疫细胞异质性机制及新型细胞群鉴定；（跨组织/器官）免疫细胞图谱研究。
3. 系统发育热点：探究胚胎发育的基因调控；解析胚胎发育中组织/器官分化机制。
内容策划：潘成
内容审核：朱卿
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1]. Wu Y, Ma J, Yang X, et al. Neutrophil profiling illuminates anti-tumor antigen-presenting potency. Cell. 2024 Mar 14;187(6):1422-1439.e24. doi: 10.1016/j.cell.2024.02.005.