Cell Metab：王晓东院士团队新型细胞死亡领域再现重磅突破

来源：丁香学术

2022 年 3 月 17 日，麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究所的 Peter Tsvetkov 和 Todd R. Golub 团队在 Science 杂志发表论文，将一种发生机制明显区别于已知的细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡及铁死亡的受控性细胞死亡方式，命名为「铜死亡」。从此，一种新型细胞死亡方式-铜死亡（Cuproptosis）吸引着国内外科研人员的热切关注，这是继铁死亡之后的又一个金属离子依赖性的细胞死亡机制。截止 2024 年 8 月，以 「Cuproptosis」 为关键词的研究型论文已发表了近 1200 篇。大量研究显示，铜离子的吸收、分布、储存和排出受到机体的严密调控，当铜稳态被打破时，细胞会发生一系列代谢障碍，引起多种疾病，如门克斯和威尔逊氏病。

2024 年 8 月 6 日，清华大学生物医学交叉研究院/北京生命科学研究所王晓东院士联合郑三多研究员在 Cell Metabolism（IF：27.7）杂志发表研究论文 Zinc transporter 1 functions in copper uptake and cuproptosis，该研究发现 Zn 转运体 ZnT1 能将铜（Cu）导入细胞，这种生理过程对于铜死亡（cuproptosis）是必需的。结构和功能分析显示，Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 在 ZnT1 中具有相同的结合位点，Zn²⁺会竞争性抑制 ZnT1 介导的 Cu²⁺ 吸收。同时，ZnT1 有助于 Lgr5+肠干细胞的稳态，可能是锌介导的威尔森氏病治疗的潜在靶点。该研究刷新了以往认知，揭示了 ZnT1 不仅是 Zn²⁺ 转运体，而且是一个重要的 Cu²⁺ 转运体，在铜死亡和 Cu²⁺ 代谢过程中扮演着重要的角色！

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1. Zn 转运体 ZnT1 将 Cu²⁺ 导入细胞，对于铜死亡是必需的

细胞内锌离子平衡主要由两类锌（Zn）转运体家族调节，SLC39 和 SLC30 转运体家族。Zn 转运体是否和 Cu²⁺ 吸收、分布以及稳态相关呢，与铜死亡究竟有何关系？为回答这个问题，研究团队首先在细胞中特异性地删除 ZnT1 基因，发现会导致细胞对 Cu²⁺ 触发的铜死亡产生抗性，而在 ZnT1-KO 细胞中异位表达 ZnT1 则可恢复这些细胞的铜死亡过程。值得注意的是，Zn²⁺ 在 ZnT1-KO 细胞中含量更高。研究员采用 CRIPSR-Cas9 技术和细胞转染验证了 Cu²⁺ 转运活性并不是 ZnT 家族的普遍特性，ZnT1 对于铜死亡是必需的，即 ZnT1 介导细胞吸收 Cu²⁺。

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2. Zn²⁺ 竞争性抑制 ZnT1 介导的 Cu²⁺ 吸收

那么，ZnT1 转运 Cu²⁺ 的具体机制是什么？研究团队采用冷冻电镜技术获得了 ZnT1 的无底物结合的 apo 结构（3.3 Å）、ZnT1-Zn²⁺ 结合结构（3.6 Å）、ZnT1-Cu²⁺ 结合结构以及功能分析，提出了 ZnT1 转运 Cu²⁺的可能机制。其中，ZnT1 的同源二聚体结构与 ZnT1-Zn²⁺结合结构几乎完全相同。在 ZnT1-Zn²⁺ 结合结构中，氨基酸 H43 和 H251 会呈现两种构象，一种构象以经典的四面体几何形状螯合 Zn²⁺，另一种构象则可能处于释放 Zn²⁺ 的状态。

后续功能分析显示，高浓度 Zn²⁺ 处理异位表达 H43A、D47A 或 D255A 突变体的 ZnT1-KO 细胞，会导致细胞死亡，因为它们无法导出胞液中过量的 Zn²⁺。重要的是，H251A 突变体仍能导出 Zn²⁺，但却不能导入 Cu²⁺。上述实验结果显示，Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 在 ZnT1 中具有相同的主结合位点，对于 Zn²⁺ 和 Cu²⁺ 的转运都至关重要，且 Zn²⁺ 会竞争性抑制 ZnT1 介导的 Cu²⁺ 吸收。

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3. ZnT1 独特的亚基间二硫键促进了 Cu²⁺ 的高效转运

那么，促进 Cu²⁺ 的高效转运的机制是什么呢？结构和功能实验结果显示，ZnT1 中氨基酸 C291、S39、E99 或 E102 的突变，会显著削弱其 Cu²⁺ 转运活性。体外实验构建了 C291S 突变体，也表现出较低的 Cu²⁺ 转运活性，进一步支持了亚基间二硫键在 Cu²⁺ 转运中的重要性。而与 Cu²⁺ 转运相反，所有这些突变体对 Zn²⁺ 转运的影响都很小。除了二硫键作用外，包括酸性氨基酸 E278、D280 和 E307，这些氨基酸可能会摄取细胞外的 Cu²⁺，对 Cu²⁺ 的转运非常重要。

研究团队提出了一个 ZnT1 介导 Cu²⁺ 转运以及 Zn²⁺ 从细胞外环境转运到细胞质的模型，揭示与 Cu²⁺ 结合后，ZnT1 的氨基酸 H43 构象发生变化，并扩展到 S39，从而破坏了 E102 和 S39 之间的氢键作用力。总之，ZnT1 的亚基间二硫键稳定了向外开放的构象，促进了 Cu²⁺ 的高效转运。

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4. 肠道 ZnT1 基因缺失导致铜缺乏和 Lgr5+ 干细胞受损

为了证实 ZnT1 在体内转运 Cu²⁺ 的能力，研究团队构建了肠上皮特异性 ZnT1 敲除小鼠，将其命名为 ZnT1^IEC-KO 小鼠。既然 ZnT1 是一种 Cu²⁺ 转运体，那么 ZnT1 的丢失是否会影响肠上皮细胞对 Cu²⁺ 的吸收呢？

研究结果显示 ZnT1^IEC-KO 小鼠体重明显下降，在 20 天内死亡。在低 Cu²⁺饮食条件下，ZnT1 丢失导致小鼠严重的肠上皮缺陷。其体内的 Olfm4 信号几乎消失，隐窝结构遭到破坏，细胞标志物 Ki67 也显著降低，Lgr5+ 干细胞受损。同时，注射 Zn²⁺ 无法挽救 ZnT1^IEC-KO 小鼠 Lgr5+ 干细胞的损伤，而小鼠肠上皮细胞和血清中的锰和铁的含量不受 ZnT1 基因缺失的影响。

研究总结与展望

本研究利用结构生物学和一系列生化实验手段，首次验证了 ZnT1 在 Cu²⁺ 转运中的功能，强调了 ZnT1 对于铜死亡是必需的，揭示了 ZnT1、铜吸收和铜死亡等生理过程对于机体稳态的重要作用，为攻克铜离子引发的一系列代谢障碍疾病提供了新的思路！

据悉，王晓东研究员和郑三多研究员为本文的共同通讯作者，王晓东实验室的博士后李叶华和郑三多实验室的博士研究生马佳豪为本文的共同第一作者，其他作者还包括王晓东实验室的博士研究生王睿，黎斌实验室的博士研究生罗袁涵宇。

作者简介

王晓东，博士，现为清华大学生物医学交叉研究院/北京生命科学研究所资深研究员及所长，美国国家科学院院士，中国科学院外籍院士。自 1995 年以来，王晓东博士主要致力于人体细胞程序性死亡的研究，程序性死亡是细胞的一种特殊生理功能，对人体正常发育、清除损伤细胞和各种退行性疾病起着至关重要的作用。王晓东博士领导的实验室发现了细胞程序性死亡的生化通路与其作用机理。2001 年担任美国德克萨斯大学西南医学中心生物医学科学杰出首席教授，2002 年担任霍华德-休斯医学研究所研究员，2003 年担任北京生命科学研究所资深研究员，2004 年被评为美国科学院院士，2013 年入选中国科学院外籍院士，2014 年入选欧洲分子生物学组织（EMBO）外籍会员，并获得多项国际生物研究奖项，其中包括 2006 年的 「 邵逸夫生命科学与医学奖 」。王晓东博士以第一作者及通讯作者身份在 Cell, Nature, Science, PNAS, Immunity, BMC Cell Biology, Molecular Cell, The Journal of Biological Chemistry，Annual Review of Cell and Developmental Biology 等高水平杂志发表研究论文和特约综述 90 余篇。

郑三多，博士，现为北京生命科学研究所研究员，清华大学生物医学交叉研究院助理教授，2015 年-2019 年于哈佛医学院从事博士后工作，2013 年-2015 年于北京生命科学研究所从事博士后工作。郑三多博士及其团队通过生物化学方法以及 X 射线晶体学、电子显微镜和核磁共振等结构手段研究膜受体信号转导的分子机制以及膜转运蛋白跨膜运输的分子机制，最终目标是研发靶向膜蛋白的新型治疗药物。以第一作者及通讯作者的身份在 Nature，Cell，Nature Communications，Science Advances，Nature Chemical Biology 等高水平期刊发表研究论文近 30 篇。

参考文献：

Li et al.,Zinc transporter1 functions incopper uptake and cuproptosis, Cell Metabolism(2024),