Sci Adv:国自然热点「巨噬细胞+成纤维细胞」发文创新思路

2024-08-06 18:31 来源:微信公众号 - ShengWuXueBa 作者:生物学霸
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这篇文章是 2024 年 3 月发表在 Science Advances 杂志上,题为「Modeling mechanical activation of macrophages during pulmonary fibrogenesis for targeted anti-fibrosis therapy」。这篇文章极具创新性,建立共培养的人巨噬细胞和成纤维细胞的纤维化微组织模型,研究吡非尼酮在使用 (i) 预防性治疗,(ii) 治疗性治疗和 (iii) 预处理三种不同的处理方式对巨噬细胞和机械活化的影响并阐明其机制。


模拟巨噬细胞在肺纤维化过程中的机械活化,用于靶向抗纤维化治疗     

杂志:Science Advances

发表时间:2024 年 3 月


研究背景


肺纤维化是一种严重且致命的肺部疾病,其特征是肺组织的结构、组成和硬度发生实质性变化,导致肺功能恶化,随后是免疫细胞的募集和激活以及异常伤口愈合。在纤维化肺中,包括独特的促纤维化亚群在内的巨噬细胞积累增加,然而不同的巨噬细胞激活状态对疾病进展和严重程度的贡献尚不清楚。


吡非尼酮 (PFD) 是美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的抗纤维化药物,已知可作用于多种纤维化途径。PFD 已被证明可减少成纤维细胞增殖,抑制 TGF-β。最近研究表明,动物模型中 PFD 可以调节巨噬细胞极化缓解纤维化,但缺乏与人类相关的疾病模型的研究。因此本文主要模拟巨噬细胞在肺纤维化过程中的机械活化并阐明其作用机制。


研究思路


在本研究中,研究人员首先通过对人纤维化肺样本的组织学和单细胞测序分析发现纤维化巨噬细胞在纤维化肺微环境中被机械激活。基于这一发现,研究人员接下来用共培养的人纤维化微组织巨噬细胞和肺成纤维细胞模拟巨噬细胞的机械活化和随后的纤维形成。最后,研究 PFD 在使用 (i) 预防性治疗,(ii) 治疗性治疗和 (iii) 预处理三种不同的处理方式对巨噬细胞和机械活化的影响并阐明其机制。


研究结果 

 

1. 肺巨噬细胞在成纤维细胞重塑的纤维化组织微环境中进行机械活化


为从空间上分析胶原、巨噬细胞和成纤维细胞在人纤维化肺中的相互作用,研究人员对患有 IPF 的供体肺组织进行组织学分析。苏木精和伊红 (H&E) 染色显示高度纤维化区域的组织结构明显重构,其特征是大量细长的细胞嵌套在密集和排列的 ECM 纤维之间 (图 1A)。包埋细胞由大量 α-sma 阳性的肌成纤维细胞和 CD206 阳性的巨噬细胞组成。肌成纤维细胞和巨噬细胞形态均呈细长状,且排列整齐,表明它们感知并响应重构的组织微环境 (图 1B)。


对人肺样本进行单细胞 RNA 测序发现肺纤维化患者特有的纤维化肺泡巨噬细胞亚群 (图 1C)。值得注意的是,编码整合素 αM,在细胞粘附和机械转导中发挥重要作用的整合素亚单位 αM(ITGAM),在 IPF 组的巨噬细胞中优先表达 (图 1D)。对数据集 GSE122960 和 GSE228232 中与机械转导途径相关的 224 个基因分析时发现,与健康供者相比,IPF 患者巨噬细胞中有 28 个基因上调 (图 1E)。


利用 GO 分析对这些基因进行功能富集分析发现,这些上调基因与细胞-基质粘附、整合素介导的信号传导和细胞运动等机械生物学过程的激活密切相关 (图 1F)。这些分析表明,肺巨噬细胞在人类 IPF 肺的广泛重塑的纤维化组织微环境中进行机械激活。 


图 1 高度重塑的纤维化组织微环境中肺巨噬细胞的机械激活


2. 巨噬细胞对地形控制的组织重塑有机械反应


为了解巨噬细胞如何对纤维化肺组织中所见的重塑组织结构做出反应,研究人员创建具有控制形态和细胞与 ECM 对齐的工程微组织。将正常人肺成纤维细胞 (NHLFs) 与 I 型胶原混合,并将其植入微孔中,微孔中含有一组按拓扑模式排列的微柱。图案设计包括螺旋图案 (图 2A)、菱形图案 (图 2B) 和方形图案 (图 2C),以模拟肺组织中的各种几何形状,如高度弯曲的肺泡壁。成纤维细胞产生收缩力,使胶原 ECM 紧贴微柱。


作为成纤维细胞介导的 ECM 重塑的结果,形态学控制的微组织按照微柱阵列模式模板形成。微组织中的 NHLF 和胶原纤维沿着微柱边界条件定义的张力线强烈共排列。因此,控制细胞和 ECM 纤维排列提供一个机会来观察到组织地形的反应。接下来,将来自人外周血的单核细胞用白细胞介素-4(IL-4) 和 IL-13 进行预极化,然后将其植入 NHLF 重建的显微组织中。这些 M2 巨噬细胞在 48 小时内粘附在显微组织表面,呈与胶原纤维和 NHLF 对齐的细长纺锤形形态 (图 2D 至 F、J、K)。


共聚焦成像显示,巨噬细胞至少部分穿透微组织,并与周围的胶原纤维和 NHLF 在三维上相互作用,如胶原纤维和巨噬细胞重叠所示 (图 2 G-I)。在沿螺旋形微组织高度弯曲边缘排列的细长巨噬细胞中检测到强表达整合素 β2(CD18),提示巨噬细胞与周围胶原纤维和 NHLFs 之间的相互作用涉及机械转导。这些发现表明,M2 巨噬细胞在纤维化样组织微环境中具有感知地形信号的能力,并根据这些信号动态调整其机械转导途径。   


图 2 巨噬细胞机械激活响应地形控制组织重塑


3. 巨噬细胞和成纤维细胞之间的广泛共排列促进了工程微组织中广泛的纤维化反应


接下来,研究人员试图探究在巨噬细胞-NHLF 共培养的微组织中,纤维化巨噬细胞如何促进纤维化的形成。将纤维化的 M2 巨噬细胞引入到 NHLF 填充的微组织表面 (图 3A)。共培养 3 天后,在微组织中观察到 α-SMA 的高表达,表明 NHLF 激活到肌成纤维细胞 (图 3B)。M2 巨噬细胞共培养的微组织中 α-SMA 的表达水平明显高于仅 NHLF 的微组织 (4.7 倍),但略低于 TGF-β1 处理的阳性对照 (图 3B-C)。


由于分化的肌成纤维细胞已显示出产生高收缩力,研究人员使用原位微柱力传感器测量单培养和共培养微组织中产生的收缩力。与 NHLF 单独培养的微组织相比,M2 巨噬细胞与 NHLF 共培养的微组织产生的收缩力高 5.7 倍 (图 3D)。当单核细胞或巨噬细胞单独接种胶原基质时,它们不能致密化胶原并形成微组织,这表明这些细胞缺乏收缩力的产生。


与收缩力测量类似,巨噬细胞-成纤维细胞共培养的微组织上清中活性 TGF-β 水平高于 NHLF 单培养的微组织 (图 3E),提示旁分泌 TGF-β 信号在巨噬细胞介导的组织纤维化中的潜在作用。由于早期研究表明巨噬细胞对成纤维细胞的激活主要发生在近距离,因此我们在共培养的微组织中检测两种细胞的作用情况。


在高显微镜分辨率下可观察到单个巨噬细胞接近和/或直接接触肌成纤维细胞 (图 3F)。TGF-β 免疫染色显示 TGF-β 信号与 CD206 共定位,而与 α-SMA 不共定位,提示这些 TGF-β 由巨噬细胞分泌并沉积到 ECM 中 (图 3 G)。    


图 3 巨噬细胞和成纤维细胞之间广泛的共排列促进了微组织中广泛的纤维化反应


4.PFD 抗纤维化治疗对巨噬细胞诱导的纤维化有作用    


PFD 和尼达尼布是 FDA 批准的治疗肺纤维化的唯一药物,两者在纤维化组织中的作用模式和细胞靶点都不明确。研究人员构建的巨噬细胞-NHLF 共培养微组织 (MaFiCo) 是研究抗纤维化药物作用的一个很好的纤维化模型。作为一种范例药物,研究人员将 PFD 应用于我们的显微组织模型,使用 (i) 预防性治疗,(ii) 治疗性治疗和 (iii) 预处理。


这些不同方案的目的是研究 PFD 在没有预先存在的纤维化状况 (预防性治疗) 或预先存在的纤维化状况 (治疗性治疗) 下的作用。在预防性治疗中,将 PFD 与巨噬细胞一起引入到 NHLF 填充的微组织中,并在共培养中维持 3 天 (图 4A)。与未处理的对照组相比,在浓度为 10 和 1000 μg/ml 时,预防性 PFD 治疗显著降低粘附的巨噬细胞数量 (图 4B-C),NHLFs 中 α-SMA 表达量分别降低 80% 和 95%(图 4B 和 D),微组织收缩力分别降低 90% 和 144%(图 4E)。


10 μg/ml 的 PFD 对培养上清中的活性 TGF-β 没有明显抑制作用,但在 1000 μg/ml 的浓度下,活性 TGF-β 水平降低 62%(图 4F)。这些结果表明,在临床相关浓度 (10 μg/ml) 下,预防性 PFD 治疗已能有效抑制几种促纤维化因子。在最高浓度为 1000 μg/ml 时,PFD 几乎完全消除巨噬细胞对微组织表面的粘附、NHLF 中 α-SMA 的表达 (图 4B)、ECM 中沉积的 TGF-β 和微组织中纤维连接蛋白的表达。


在这种情况下,少数剩余的巨噬细胞表现出超细长的形状,这与未经治疗的对照组的纺锤体形状明显不同 (图 4B)。由于在预防性治疗中,微组织不具有预先存在的纤维化特征,这些结果表明,破坏巨噬细胞对微组织的粘附抑制纤维化的发展。    


图 4 预防性抗纤维化治疗对共培养微组织的影响


在治疗方案中,巨噬细胞与 NHLF 共培养 3 天形成纤维化微组织,然后再引入 PFD 3 天 (图 5A)。与未处理的对照显微组织相比,PFD 治疗仅适度减少附着的巨噬细胞数量 (40%)(图 5B-C),NHLFs 中 α-SMA 表达 (47.5%)(图 5B 和 D),以及上清中活性 TGF-β 水平 (图 5F)。


PFD 处理下显微组织收缩力的变化不显著 (图 5E)。此外,PFD 处理导致粘附的巨噬细胞形态从纺锤形到丝状,发生显著变化 (图 5B),这在预防性治疗中可以看到。然而,与预防治疗相比 (图 4C),治疗治疗中更多的巨噬细胞仍然粘附 (图 5C)。    


图 5 治疗性抗纤维化治疗对共培养微组织的影响


由于 PFD 治疗同时影响巨噬细胞和 NHLF,研究人员接下来用 PFD 预处理巨噬细胞,以消除其对这两种细胞类型的影响。首先用巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 处理人外周血源性单核细胞,然后加入 PFD 处理 24 小时,再用 IL-4/IL-13 诱导 M2 极化 24 小时 (图 6A)。在诱导的 M2 极化过程中加入 PFD 可以抑制 CD206 的表达,并以剂量依赖的方式降低巨噬细胞单培养上清中的活性 TGF-β 水平,而不影响细胞活力或塑料培养皿上的粘附。



然后将这些预处理的巨噬细胞接种到 NHLF 填充的微组织中,并在不进一步添加 PFD 的情况下维持。共培养 3 天后,在 10 和 1000 μg/ml 的 PFD 预处理下,粘附的巨噬细胞数量分别减少 59% 和 72%(图 6B-C),NHLFs 中 α-SMA 的表达分别减少 80% 和 93%(图 6,B 和 D),显微组织收缩力分别减少 100%(图 6E),活性 TGF-β 水平分别减少了 35% 和 50%(图 6F)。


综上所述,这些结果表明 PFD 既抑制巨噬细胞诱导的 M2 极化,也抑制巨噬细胞粘附于 NHLF 填充的显微组织的能力。由于这两种功能都与巨噬细胞介导的纤维化有关,PFD 可能作用于巨噬细胞,影响它们对纤维化过程的贡献。 


图 6 抗纤维化预处理对共培养微组织的影响


5.PFD 通过抑制 ROCK2 和整合素 αMβ2 抑制巨噬细胞的机械活化


PFD 治疗降低巨噬细胞在显微组织上附着、排列和扩散的能力,这些都是依赖于细胞粘附的细胞功能。反过来,M2 极化已被证明需要强粘附和细胞内细胞骨架重组。同时,研究人员在已发表的 IPF 患者肺巨噬细胞 scRNA-seq 数据集中发现与机械转导过程相关的上调基因,如细胞-基质粘附、整合素介导的信号传导和细胞运动 (图 1)。


在这些基因中,RAS 同源家族成员 A(RHOA),ITGAM 和高度上调的基因都与细胞-基质粘附和整合素介导的信号传导密切相关。因此,一研究人员将重点放在 RhoA 相关通路、αM 整合素和 β2 整合素上,以研究 PFD 是否通过作用于巨噬细胞的机械感知和激活来抑制纤维形成。Rho 相关激酶 ROCK1 和 ROCK2 是 RhoA 的主要下游效应物,ROCK2 在抗纤维化药物 KD025 的临床试验中被用作治疗靶点。共培养微组织中 ROCK2 免疫染色显示,ROCK2 主要在 M2 巨噬细胞中表达。


在预防和治疗两种治疗方案中,PFD 治疗导致 ROCK2 表达分别降低 65% 和 74%(图 7A-C)。接下来,用 ROCK2 特异性抑制剂 KD025 处理共培养的微组织,以确定对巨噬细胞机械激活的抑制是否是 ROCK2 特异性的。结果显示,KD025 在预防性和治疗性治疗中分别导致 ROCK2 表达降低 39% 和 21%(图 7A-C),同时粘附的巨噬细胞数量显著减少 (预防性 75%,治疗性 67%)(图 7D-E),巨噬细胞形态从纺锤形转变为丝状,活性 TGF-β 显著降低 (预防组 62%,治疗组 15%)(图 7F-G)。


为确定上述作用是否对巨噬细胞具有特异性,研究人员在硅胶基质 (刚度为 4 MPa) 上对单培养 M2 巨噬细胞进行 PFD 和 KD025 处理。如附属图所示,PFD 处理和 KD025 处理显著降低 ROCK2 的表达,同时巨噬细胞数量减少,活性 TGF-β 减少 40% 和 35%,表明 ROCK2 途径的抑制是 M2 巨噬细胞特异性的。接下来,研究人员检测 αM 和 β2 整合素在共培养显微组织中的表达。


免疫染色显示这些整合素仅在 M2 巨噬细胞中表达。在预防和预处理方案中,PFD 治疗导致 αM 和 β2 整合素亚基的表达分别减少 64% 和 83%(图 7 H-I)。为确定这种作用是否对巨噬细胞具有特异性,对单培养的 M2 巨噬细胞进行 PFD 治疗。在单一栽培中,PFD 处理也显著降低 αM 和 β2 整合素的表达。


由于 RhoA/ROCK 信号通路影响整合素的表达,研究人员也使用 KD025 处理 M2 巨噬细胞单培养。KD025 抑制 ROCK2 显著降低 αM 和 β2 整合素的表达。综上所述,PFD 对巨噬细胞包括 ROCK2、αM 和 β2 整合素在内的机械转导通路具有抑制作用,其作用与 ROCK2 选择性抑制剂 KD025 相似。   


图 7 PFD 通过抑制 ROCK2 和整合素 αMβ2 抑制巨噬细胞的机械活化


文章小结


本研究中,研究人员通过构建巨噬细胞和成纤维细胞共培养的纤维化组织模型以研究纤维化微环境中免疫-基质相互作用。结果发现机械激活的巨噬细胞与胶原纤维,成纤维细胞相互作用促进微组织中广泛的纤维化,使用 PFD 抗纤维化治疗可以通过抑制 ROCK2 和整合素 αM/β2 抑制巨噬细胞活化从而抑制纤维化。


编辑: 王凯

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