导师
近期发现实验室里有人专做「经费小偷」！肿瘤细胞做个外泌体提纯，几个月了，什么都没提取出来还浪费了珍贵样本。小李，说的就是你，再来一次你就等着延毕吧！
可我也是按照 protocol 一步步提取的，白天离心机排不上队，还加班熬夜离心了好多次，结果不是纯度差就是得率低，我也很无奈……
小李
提取纯化外泌体常用的差速离心法是利用从 3,000 g 到 100,000 g 的多次离心循环来分离密度、大小和质量一定区间内的物质。如果样本自身的细胞碎片多或者外泌体浓度很低，确实很难拿到纯度高得率足够的外泌体，而且离心的过程多少也会影响外泌体的活性和完整性。
那么如何快速提纯外泌体？可以考虑宇玫博最新研发的提取方式！无需借助离心机，利用层析法仅需 1 h 即可实现更高纯度的外泌体提纯，得率也毫不逊色。更适用于细胞培养上清液、尿液等非粘稠性样本中的外泌体提取纯化。好不好用，试过才知道，点击下方图片或扫码，即可免费申请试用～
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1 h 快速外泌体提纯法实验流程
操作视频
详细操作步骤
一、样品预处理
1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后置于 4 ℃ 解冻，融化后置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后直接置于冰上；
2、样品处理量（单个柱子处理量）：
注：每个「Exosome Extraction Column」处理量 10～20 mL（未经浓缩的原始上清），样品过少可能导致获得的外泌体浓度低，样品过多可能导致堵柱。
3、离心去细胞：样品于 4 ℃ 以 300 ×g（～1,640 rpm**）离心 5 min，去除样品中的细胞；**为约 10 cm 有效离心半径的大离心机换算（≥ 15 mL 离心管），下同。
4、离心去细胞碎片：将去除细胞后的样品于 4 ℃ 以 3,000 ×g（～5,200 rpm**）离心 10 min，去除样品中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可 3,000 ×g，10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；
5、上清液过滤：去除细胞碎片的离心上清液用 0.45 μm 或 0.22 μm 过滤器过滤至新的容器中。
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二、提取前准备
1、固定外泌体提取柱（Exosome Extraction Column）：取出提取柱，将提取柱上下筛板取下后垂直固定于试管架或铁架台上，待填料保存液自然流尽；
2、加入 Solution A 溶液：填料保存液流尽后沿柱子内壁缓慢加入 5 mL Solution A 溶液，待 Solution A 溶液自然流尽；
3、加入 Solution B 溶液：Solution A 流尽后沿柱子内壁缓慢加入 5 mL Solution B 溶液，待 Solution B 溶液自然流尽，等待上样。
三、提取外泌体
1、过柱：将经 0.45 μm 或 0.22 μm 过滤器过滤后的细胞上清液沿柱子内壁缓慢多次加入提取柱中，待细胞上清液自然流尽（注：每个「Exosome Extraction Column」上样量 10～20 mL（未经浓缩的原始上清），样品过少可能导致获得的外泌体浓度低，样品过多可能导致堵柱）；
2、平衡：细胞上清液流尽后沿柱子内壁缓慢多次加入 15 mL Solution B 溶液，待 Solution B 溶液自然流尽；
3、洗杂：Solution B 溶液流尽后沿柱子内壁缓慢加入 0.8 mL Solution C 溶液，待 Solution C 溶液自然流尽；
4、洗脱：待上步骤中 Solution C 溶液流尽后沿柱子内壁再次缓慢加入 1 mL Solution C 溶液，收集该流穿液（该流穿液中富含外泌体颗粒）；
5、浓缩（选做）：若外泌体浓度过低，可用 100 KD 超滤柱将流穿液适当浓缩；
6、纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4 ℃ 以 3,000 ×g（～6,200 rpm*）离心 10 min，离心后收集 EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体（注：EPF 柱不可重复使用）；*为约 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤ 2 mL 离心管）。
7、外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80 ℃ 低温冰箱中，以备后续实验使用。
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注意事项
1、新的 Exosome Extraction Column 柱子的上筛板和填料表面之间可能存在一定的空隙，该现象是运输过程中晃荡造成的，并不影响其性能，实验前将筛板向下推动至填料表面即可；
2、Exosome Extraction Column 和 Exosome Purification Filter 均为一次性耗材，请勿重复利用，否则可能会造成堵柱而损失样品；
3、Solution C 为 Tris 缓冲盐溶液；
4、流穿液呈红色，是由于培养基中色素和外泌体同时被洗脱所致，不影响后续实验。若需去除色素，可使用 100 KD 超滤柱置换缓冲液；
按照以上步骤，通过阴离子交换色谱法原理，填料与被分离样本中带负电荷的外泌体相结合，可以更好适用于细胞培养上清液、尿液等非黏稠性样本中的外泌体提取纯化。宇玫博外泌体提取纯化试剂盒-柱纯化，助你搞定每一次外泌体提纯。
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产品优势
● 方便快速：提取过程不需要高速离心机，上样到获得外泌体仅需 1 h
● 稳定性高：无剪切力，保留外泌体的完整性和生物活性
● 纯度高：层析法纯度更高，回收率 30%，粒径均一且重复性好
成功案例
悬浮 293 细胞上清项目
葡萄外泌体项目
工艺流程：榨汁 → 纱布过滤 → 低速离心 → 高速离心 → 调节 pH → 高速离心 → 0.22 μm 滤膜过滤 → 试剂盒提取
牛奶外泌体项目
工艺流程：去脂 → 去蛋白 → 调 PH → 多级澄清过滤 → 试剂盒提取
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内容策划：王丹琦
内容审核：吴军
题图来源：图虫创意