出人意料，现在做 qPCR 也要「卷」！这不，导师提议举行一次「qPCR 最美曲线」评选大赛，实验群炸开了锅……
小师妹
我这熔解曲线又有杂峰，这不纯纯陪跑嘛！
一世英名毁于一旦，我的阴性质控扩增曲线有翘尾……
大师兄
师弟
看来我胜券在握！不枉我一番苦练啊！
厉害啊，师弟！还有隐藏技能，教教我们呗～
师姐
师弟
那当然，我可是做过功课的，课程也推荐给你们！
qPCR 可是科研人的必备技能，说起 qPCR 的实验经历，几乎人人都能吐槽两句。除了曲线杂乱无章，还有实验重复性差，对照设置错误等等……那么，出现这些问题的原因有哪些？如何解决？ 数据如何分析？
不用担心，师弟推荐的宝藏课程来啦！天隆科技将于 6 月 6 日 14:00 开展线上专题课程《qPCR- 从实验流程到常见问题解析全攻略》，从实验流程、注意事项到数据分析解读，全方位剖析 qPCR 实验技巧，更有常见问题解析和案例分享，帮助大家实现技能进阶，得到理想数据！参与直播还有机会赢取手机支架、收纳包等 100 份精美好礼！
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一.常见问题解析
1. 熔解曲线出现杂峰：
1）杂峰在主峰之前，说明存在引物二聚体，建议需要重新设计引物。
2）杂峰在主峰之后，大多由非特异性扩增引起，建议调整稀释倍数、减少引物。
2. 扩增曲线抖动，不光滑或没有平台期
可能因为仪器不准或模板不纯。建议进行仪器校准；增大模板稀释倍数。
3. 实验重复性差
1）样本问题：每次实验尽量保证样品部位、处理条件的一致性，确保提取核酸的纯度。
2）技术问题：通过定期校准加样器、配制预混合液、去除气泡等规范实验操作。
二.实验设计中的对照设置
完整的 qPCR 实验设计应包括实验组（处理样本）、阳性对照组（野生型或参考样本）、阴性对照组、空白对照组。
其中，空白对照，即未添加模板的 qPCR 体系，用来验证 qPCR 体系是否受到污染。阴性对照，即添加阴性模板的 qPCR 体系，用于排除实验操作导致的假阴性。
三.数据处理（相对定量法）
1.目的基因 Ct 值的归一化：
ΔCt（实验组）= Ct（实验组的目的基因）-Ct（实验组的内参基因）
ΔCt（对照组）= Ct（对照组的目的基因）-Ct（对照组的内参基因）
2.实验组 ΔCt 的归一化：
ΔΔCt = 各样本的 ΔCt- 对照组的 ΔCt
3.表达水平的差异倍数：2 –ΔΔCt
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内容策划：潘成
内容审核：钟可可
题图来源：图虫创意