随着免疫疗法的发展，已有多种靶向免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1/CTLA-4）的药物用于临床癌症治疗。如何更好地预测免疫治疗响应性，选择合适的免疫疗法？研究人员一直致力于寻找相关肿瘤生物标志物。其中，细胞外囊泡（EVs）作为新型疾病标志物，受到越来越多关注。
最新研究！2024 年 3 月，J Extracell Vesicles 发表一项临床研究 PD-L1 on large extracellular vesicles is a predictive biomarker for therapy response in tissue PD-L1-low and -negative patients with non-small cell lung cancer，发现即使患者组织中 PD-L1 表达水平较低，只要胞外囊泡（EVs）中 PD-L1 表达水平高也能很好地响应免疫治疗。提出血浆中 PD-L1 阳性水平可以作为免疫治疗的新的预测和预后指标，为免疫疗法的选择和效果预测提供新思路[1]。
由此可见，EVs 含有的特定分子，在疾病诊断/治疗中受到广泛关注。高效分离、纯化细胞外囊泡也显得至关重要。早在 2022 年，Marjo 等人比较用不同的方法评估 EVs 纯度和生化特性[2]。然而由于其异质性，EV 的分离和纯化仍具有挑战性，没有任何一种技术可以在多种不同的样品中达到令人满意的纯度。
目前，已有离心、超滤、层析等多种技术用于分离纯化 EV。研究者需要更多的标准化和自动化方法。
一、新一代温和自动化分离技术：尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱（SEC）作为 EV 分离方案中的一种有价值的方法已获得广泛认可，其具有条件温和、结果可重复的潜力，并且能够以合适且理想的纯度和完整性分离 EV，以满足后续应用。Bio-Rad 公司的应用团队开发了一个基于分子筛原理的层析分离、纯化、表征 EV 的工作流程。
本工作流程中，使用 Bio-Gel A-1.5m Gel 的分子筛层析柱作为分离，在 NGC 自动化层析系统上对含有 EV 的样品进行层析分离，分离出来的组份自动收集在收集器的试管中，各组份经纳米颗粒跟踪分析（NTA）、Stain-Free 免染电泳及多重荧光 WB 技术进行表征。
实验结果表明，该流程可有效、高产量的富集 EV。
二、层析技术工作流程
层析系统：
NGC Quest 10 Plus 层析系统，同时使用 220、260 和 280 nm 三个检测通道。并配有 BioFrac 或 NGC 组份收集器（96 孔盘）。使用 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）作为流动相。
层析柱及填料：
使用 Bio-Gel A-1.5m 预装分子筛层析柱或其他等效的凝胶分子筛填料，柱体积为 1～20 ml 。
层析柱测试表征：
使用 Blue Dextran MW 2M Da 及 Bio-Rad Gel Filtration Standard 标准蛋白混合样对柱效进行表征。
纳米粒子追踪分析：
使用 Particle Metrix 的 PMX 220 ZetaView TWIN 在 520 nm 处通过 NTA 测量分子筛层析前、后样品中颗粒的浓度和尺寸分布。系统配备 405 和 520 nm 两个激光器。
电泳和多重 WB 表征：
使用 Criterion TGX Stain-Free 预制免染凝胶获得层析后的总蛋白凝胶电泳图像。EV marker 的 WB 检测使用多重荧光标记抗体同时检测，凝胶及 WB 图像使用 ChemiDoc MP 成像系统获得。
结果
CCM 样品在 Bio-Gel A-1.5m 色谱柱上的 EV 分离的色谱图。在 260 nm 和 280 nm 处记录洗脱曲线，收集器将 250 µl 馏分收集到 96 孔板中。
分子筛层析分离后的组份粒度分布（对数刻度），绿色为 Bio-Gel A-1.5m 色谱柱，紫色为其他层析柱。
分子筛层析前后及各组份的蛋白电泳结果。
多重荧光 WB 对 EV marker 的表征分析。
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* 本产品仅用于科研，不可作临床诊断使用。
* Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
内容策划：潘成
内容审核：周育红
题图来源：伯乐生命科学
参考文献：
[1]. Schöne N, Kemper M, Menck K, et al. PD-L1 on large extracellular vesicles is a predictive biomarker for therapy response in tissue PD-L1-low and -negative patients with non-small cell lung cancer. J Extracell Vesicles. 2024 Mar;13(3):e12418. doi: 10.1002/jev2.12418.
[2]. Zini J, Saari H, Ciana P, et al. Infrared and Raman spectroscopy for purity assessment of extracellular vesicles. Eur J Pharm Sci. 2022 May 1;172:106135. doi: 10.1016/j.ejps.2022.106135.