最近，师弟正在进行细胞毒性检测实验，但细胞养了一批又一批，结果依旧不尽人意！
师弟
师兄，我要崩溃了，做 MTT 实验加样后细胞状态总是很差，做了 100 板，数据还是无法重复，怎么办啊？
MTT 细胞毒性较大，影响细胞状态，可以试试毒性小，检测时间短且灵敏度高的 CCK-8 ！
师兄
师弟
原来如此，谢谢师兄～
想要实验数据更加准确、可靠，好的试剂可以让我们实验时少走很多弯路～
美仑 CCK-8 试剂盒助您一臂之力，让您的科研工作更加高效、便捷！
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美仑 CCK-8 试剂盒具有灵敏度高、反应时间短、线性范围宽等特点，广泛应用于药物筛选、细胞增殖/毒性测定、肿瘤药敏试验。
我们基于代谢活性、ATP 水平、DNA 合成、膜损伤以及细胞荧光标记等原理，总结了一些方法。然而，如何根据实验需求选择最适合的检测方法，并解读不同方法带来的数据差异，是我们在实际操作中经常遇到的难题。
在这里，我们逐一探讨这些检测方法的原理、优缺点以及在实际科研中的应用。
一、代谢活性检测
通过在细胞中添加四氮唑盐，测定线粒体内脱氢酶代谢活性。活细胞能将四氮唑盐（如 MTT、XTT、WST-1、CCK-8）还原为有色的甲瓒（Formazan），通过分光光度计或酶标仪定量检测。
目前代谢活性检测中应用最广泛的是 CCK-8 和 MTT。
CCK-8 原理：Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8）中含有的 WST-8 在电子耦合试剂 1-Methoxy PMS 存在下，被线粒体内的脱氢酶还原为橙黄色 Formazan，生成的 Formazan 数量与活细胞数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析：细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
MTT 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为蓝紫色结晶——Formazan 并沉积在细胞中。某些试剂能溶解细胞中的 Formazan，用酶标仪在特定波长（如 570 nm）处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比：吸光度越大，表示细胞活性越强，说明药物毒性越小。
常用代谢活性检测方法的优缺点比较
检测方法
使用酶标仪或分光光度计检测吸光度。
应用场景
细胞增殖测定、细胞毒性测定、细胞活性测定、药物筛选、肿瘤药敏试验、微生物对细胞毒性或增殖的测定。产品信息（美仑货号：MA0218）、（美仑货号：MA0198）
二、ATP 水平测定
活细胞需要不断以 ATP 的形式输入自由能，因此，通过高灵敏、快速且稳定的荧光素酶发光法检测 ATP 增加水平，可有效反映细胞增殖情况。
ATP 水平测定最具代表性的方法是 CTG。
CTG 原理：ATP 生物发光技术的原理是荧光素酶以荧光素、三磷酸腺苷（ATP）和 O2 为底物，在 Mg2+ 存在时，将化学能转化为光能。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP 在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。CTG 试剂盒采用生物发光（bioluminescent）法，利用 Firefly luciferase（萤火虫荧光素酶）催化底物——荧光素的转化，高效利用 ATP 的能量，发射出光子。发光信号与 ATP 量呈正比，而 ATP 与培养基中的细胞数目呈正比。
CTG 方法的优缺点
优点：
1
简化检测步骤：均质的「加样-混合-检测」方案减少了其它同类检测所需的操作步骤。
2
细胞用量更少：比 CCK-8 的灵敏度更高，可精准探测低至比色及荧光法限下的细胞数，减少了检测所需细胞数。
3
更迅速获得结果：加入试剂后 10 分钟就能获得数据。
4
可自行选择检测方案：适配不同类型多孔板，数据记录支持发光检测仪或 CCD 成像设备。
5
可连续处理培养板：发光信号稳定，样品可进行批量处理和高通量筛选。
缺点：
价格较贵；检测仪器需要带发光检测通道；检测后细胞死亡。
检测方法
使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。
应用场景
快速、高灵敏的进行药物高通量筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、细胞活性测定、肿瘤药敏试验、微生物对细胞毒性或增殖的测定。产品信息（美仑货号：PWL111）
三、DNA 合成检测
细胞的增殖生长伴随着 DNA 的合成，因此 DNA 的合成可以被用来检测细胞增殖、活力及凋亡。核苷渗入法直接检测细胞中 DNA 的合成，是目前公认的最精确的检测细胞增殖的方法。
DNA 合成检测可以用 BrdU 和 EdU 方法。
EdU 原理：试剂盒中的 EdU（5-ethynyl-2' -deoxyuridine）是一种胸苷（T）类似物，EdU 可以在细胞周期的 S 期中替代胸苷掺入到新合成 DNA 中；其乙炔基与叠氮化物（如荧光探针偶联 Azide）经 Cu+ 催化，迅速发生共价反应，即点击反应（Click reaction)，使新 DNA 被荧光标记。荧光信号检测可直观反映细胞增殖情况：荧光越强，增殖越多。
EdU 方法的优缺点
优点：
1
准确-----标记率高且无需 DNA 变性(酸解、热解、酶解等)，避免样本损伤，从而确保细胞核边缘清晰完整。
2
简单-----简单高效，仅需三步：EdU 孵育、细胞固定、荧光检测。无需 DNA 变性和孵育抗体。
3
快速-----无需过夜，省却抗原抗体反应。整个检测过程只需 2.5 小时。
4
安全-----不使用 [3H]thymidine，无放射性污染。
5
灵敏-----无需抗体，检测染料仅为 BrdU 抗体的 1/500，更容易扩散，即使单个增殖细胞也能准确检测。
6
兼容-----允许与多种抗体或荧光蛋白同时标记，能够同时检测细胞其他性状特征。
缺点：
较代谢活性检测和 ATP 水平测定方法来说，步骤较多，不适合高通量筛选。
检测方法
荧光标记 EdU 使用荧光显微镜、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
应用场景
直观检测细胞增殖情况，单细胞水平检测细胞分裂增殖情况，也应用于细胞 DNA 修复、分化及细胞标记物追踪等方面。EdU（美仑货号：MA0424/MA0425）是 BrdU 的升级版，更灵敏、更安全、更便捷。
四、膜损伤检测
膜损伤检测是利用活死细胞膜完整性的不同，进入细胞内染料情况的不同，从而检测细胞活率的方法。通过计算染料摄取比例，就可以反映细胞的增殖或毒性情况。
膜损伤检测包括最常用的台盼蓝、Calcein AM/PI、LDH 等。
Calcein AM/PI 原理：该方法利用荧光染色技术，同时评估细胞内酯酶活性和质膜完整性，以判断细胞活力。试剂盒内含有两种染料：钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI），Calcein-AM 可透过活细胞膜，与酯酶作用生成具有强烈荧光信号的绿色荧光物质 Calcein（Ex/Em：495nm/515nm）。PI 不能透过活细胞膜，但细胞膜受损时可进入到死细胞内并与核酸结合，产生明亮的红色荧光（Ex/Em：535 nm/617 nm）。用 490 nm 激发时可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；而用 545 nm 激发时仅可观察到死细胞。活细胞细胞质成绿色荧光，死细胞细胞核呈红色荧光。
Calcein AM/PI 方法的优缺点
优点：
1
操作简便，方法可靠。
2
可单细胞观察，较为直观。
3
与其他方法不同的是，可以用荧光酶标仪或流式细胞仪进行定量，得到活死细胞比率。
4
与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM 的细胞毒性很低更适合于活细胞的检测。
缺点：
只反映活/死细胞情况，不能体现增殖代谢水平，不适合高通量筛选。
检测方法
倒置显微镜、细胞计数仪；Calcein AM/PI 使用荧光显微镜、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
应用场景
计算细胞活率，进行活细胞和死细胞水平的分析，也可用于一些生物相容性评价。（美仑货号：MA0130）（美仑货号：MA0361）
五、细胞荧光标记检测
采用无毒荧光标记物对细胞特定结构进行标记，保持细胞生物活性与增殖能力，通过对增殖细胞群体荧光强度的测定进而反映出细胞的增殖情况。
检测细胞增殖最常用的荧光探针是 CFDA SE（CFSE）。
原理：CFSE 是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可在活细胞内聚积并与胞内蛋白共价结合，水解后的 CFSE 释放出荧光物质。当细胞分裂时，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。在一个增殖的细胞群体，各连续代细胞的荧光强度呈对数递减，利用流式细胞仪在 488 nm 激发光和荧光检测通道可对其进行分析，从而得到细胞增殖情况。
CFSE 方法的优缺点
优点：
1
活体标记：可以追踪细胞在体内的分裂增殖过程。
2
时间长：标记的荧光可以维持长达数周之久。
3
特定跟踪：可以与细胞亚群特定抗体结合使用。
4
稳定：进入细胞后荧光不受内环境影响。
5
结果客观：对细胞生理活动没有任何影响。
缺点：
检测周期长，数据分析较复杂，不适合高通量筛选。
检测方法
使用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光酶标仪检测。
应用场景
在单个细胞水平上动态分析细胞增殖，定量活细胞数目，进行均一染色的细胞示踪观察。（美仑货号：MB2308/MA0697）
看完上述的干货后，相信老师同学们都获得了不小的收获。在研究细胞增殖与活力时，您是否也曾遇到过方法选择不当、数据解读困难或实验成本过高等问题？别担心，解决方案已为你能准备好！
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内容策划：潘成
内容审核：钟可可
图片来源：美仑生物
题图来源：图虫创意