众所周知，福尔马林固定石蜡包埋的组织样本（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）是医学领域常见的生物材料，也是目前长期保存病理标本的金标准。医院病理科档案中往往积存了大量的石蜡包埋组织，虽然这些被存档样品因为前期固定包埋的时候，发生了核酸片段化、蛋白与核酸交联等情况，但随着基础研究和分子生物学相关技术的不断发展，FFPE 样本的技术局限逐渐被破解。
FFPE 样本发文数量（数据来源 NCBI，统计截止 2023.11）
如今 FFPE 样本可以在空间和游离两个层面上开展蛋白组和转录组的研究，包括空间蛋白组（IMC、CODEX、mIHC）、空间转录组（10x Visium CytAssist）、单细胞转录组测序（M20-seq），这些技术单一/联合应用将有助于广大临床科研用户揭开 FFPE 样本尘封已久的宝贵信息，为医学病理和机制研究、药物发现和回顾性研究带来新的发现。
接下来为您详细介绍一下 FFPE 空间 & 单细胞多组学研究技术，利用这些技术在肿瘤、免疫、神经、感染等不同疾病中分析免疫细胞、肿瘤细胞、基质细胞、成纤维细胞等细胞间在空间上的互作以及与病理、机制、预后间的关系。
空间蛋白组
Spatial Proteome
1.1 组织成像质谱流式（Imaging Mass Cytometry, IMC）
IMC 采用金属元素作为抗体的标签，无背景干扰，也无需考虑补偿计算，可以实现同一视野内单细胞上 40+ 标志物的原位蛋白检测，能够对组织结构细胞及浸润免疫细胞进行系统的分析。
Panel 设计灵活简便、短短几日即可实现；单次收样即可捕获所有感兴趣靶标（40+）；利用 IMC 简化空间成像。
IMC 技术原理
FFPE 样本应用 IMC 技术做的相关研究，2023 年 IF > 40 的文章就已发表 7 篇：
乳腺癌：原位绘制多细胞肿瘤生态系统图，发现了关键的 ICB 反应预测因素，并表明 ICB 独特地重塑了肿瘤的结构（Nature）[1]；
肺癌：深度解析肺癌免疫微环境，确定了与患者生存相关的分子特征及空间特征，并以此为基础构建了可预测非小细胞肺癌术后疾病进展的模型（Nature）[2]；
脑转移瘤：揭示了原发性肿瘤和不同实体癌脑转移之间的免疫景观差异，同时在胶质母细胞瘤患者中发现了与一种长期生存相关的髓过氧化物酶（MPO）阳性巨噬细胞群（Nature）[3]。
……
1.2 超多色原位荧光蛋白检测 (Co-detection by indexing, CODEX/PhenoCycler-Fusion)
CODEX 的核心设计包含两个部分：其一是检测试剂，由标记特异性寡核苷酸标签序列（Barcode）的一抗组成；其二是成像试剂，由标记荧光基团的 Barcode 互补探针组成。
全片空间扫描，获得全景组织信息；低至 0.25 mm 的单细胞分辨率；一步抗体染色，无需脱色，最小限度减少组织损伤，可支持样本后期更多分析；全流程自动化操作，避免人工误差。
CODEX 技术原理
无独有偶，今年也有不少科研用户通过 CODEX 技术让实验室的 FFPE 样本重见天日：
神经胶质瘤：对原发性肿瘤切除和双载体 Ad-hCMV-HSV1-TK 和 Ad-hCMV-Flt3L 治疗肿瘤复发时获得的肿瘤样品中免疫细胞类型的表型和定量，揭示双载体基因治疗恶性神经胶质瘤的杀伤作用机制（The Lancet Oncology）[4]；
膀胱癌：分析自然发生的 LOY 突变膀胱癌以及 Y 染色体靶向缺失的膀胱癌样本中的免疫微环境差异，揭示了癌症中 Y 染色体的丢失通过逃避适应性免疫驱动肿瘤的生长（Nature）[5]；
肝癌：根据 CD163+TAMs 的共定位和功能状态（PD-L1 表达），描述了 MAIT 细胞的动态表型，发现 HCC 中的 MAIT 细胞显示肿瘤浸润受损，功能障碍和细胞毒性丧失，揭示了在肿瘤外启动的 MAIT 细胞表型状态之间的协调转变（Cell）[6]。
……
1.3 多重荧光免疫组化技术 (Multiplex immunohistochemical，mIHC)
mIHC 也称作酪氨酸信号放大（TSA）技术，是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。mIHC 借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。
mIHC 技术原理
空间转录组
10x Visium CytAssist
在 Visium CytAssist 工作流程中，切片、组织制备、染色（H&E 或 IF）和成像都在标准载玻片上进行。在探针杂交后，将两张标准载玻片和一张带有两个捕获区域的 Visium 玻片放入 CytAssist 仪器中，让标准载玻片上的组织切片与捕获区域对齐。仪器捕捉明场图像，为数据分析提供空间定位,随后将转录组探针与 Visium 玻片杂交。
10x Visium CytAssist 技术原理
10x Visium CytAssist 项目流程
FFPE 单细胞测序
M20-seq
M20-seq 技术基于随机引物原理，在细胞（核）/细菌内原位逆转录后进行单细胞标记及测序。M20-seq 基于随机引物原理可对 RNA 分子全长进行无偏捕获，此外可以捕获包含 lncRNA、CircleRNA 在内的非编码 RNA。
M20-seq 技术原理
茵菲生物专注提供 FFPE 多组学一站式完整解决方案，今年已进行了近百项 FFPE 多组学项目。通过 FFPE 多组学技术应用，对组织样本进行高维、原位数据的采集，以单细胞分辨率的基因表达数据结合空间背景表征信息，共同探究疾病潜在的调控网络机制，助力广大临床科研用户加速推进在疾病病理形态、分子变化，辅助诊断和治疗方向的研究和突破。
内容审核：潘成
项目审核：朱卿
图片来源：茵菲生物
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1]. Sorin M, Rezanejad M, Karimi E, et al. Single-cell spatial landscapes of the lung tumour immune microenvironment. Nature. 2023.
[2]. Karimi E, Yu MW, Maritan SM, et al. Single-cell spatial immune landscapes of primary and metastatic brain tumours. Nature. 2023.
[3]. Wang XQ, Danenberg E, Huang CS, et al. Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer. Nature. 2023.
[4]. Umemura Y, Orringer D, Junck L, et al. Combined cytotoxic and immune-stimulatory gene therapy for primary adult high-grade glioma: a phase 1, first-in-human trial. Lancet Oncol. 2023.
[5]. Abdel-Hafiz HA, Schafer JM, Chen X, et al. Y chromosome loss in cancer drives growth by evasion of adaptive immunity. Nature. 2023.
[6]. Ruf B, Bruhns M, Babaei S, et al. Tumor-associated macrophages trigger MAIT cell dysfunction at the HCC invasive margin. Cell. 2023.