单细胞研究能够从更高分辨率和时空结构上解码生命。自 2013 年开始，单细胞测序技术多次被 Science、Nature 等学术期刊评价为年度重点技术，正引领新一轮生物医学领域的技术革命。自 2017 年开始，PubMed 中单细胞相关的发文量以 34% 的年复合增长率在增加，今年已发表 4919 篇。
图 1：PubMed 中单细胞发文趋势
显而易见，单细胞转录组测序几乎已经是科研必备品，但拿到数据后，难题也接踵而至：
你是否面对海量的结果不知如何解读？
是否做完亚群分类就进行不下去了呢？
是否还在为没有好的数据分析思路发愁？
别急！这篇文章将结合案例，从初步数据分析、样本整合到进阶版针对性分析三个方面为您解答疑惑。单细胞测序那点事儿，保证整得明明白白（文末含福利）~
Step1 测序数据质控
Cell ranger得到的网页版报告（web_summary.html）包含了常规的质控信息、比对基因组结果、初步的细胞聚类和差异分析结果。ps：当报告头部出现黄色或红色的警告框（图 2），需要查看基因组的比对情况，数据量的饱和度情况，无异常信息之后才是我们可以放心使用的可靠数据。
图 2：报告警告页面
Step2 样本整合分析
为了进行更加细致的基因表达分析或整合多个样本的数据进行比较，可以使用 Seurat 软件提取 Cell Ranger 分析得到的结果，对单细胞表达聚类和基因的表达量进行分析。
1. 应用 Seurat 重新对合并的数据进行细胞聚类分析，将各个 cluster 进行差异分析，挑选高表达的基因展示其在所有 cluster 中的表达情况（图 3 左），依据 marker 基因数据库对细胞类型进行预测（图 3 右），从而得到样本所包含的细胞类型及每类细胞特异性高表达的基因。
图 3：用 Seurat 对合并的数据进行细胞聚类分析
2. 对 Seurat 分群结果筛选得到的每个 cluster 的差异表达基因，进行 GO 功能富集分析、KEGG 富集分析、GSEA 分析及蛋白质互作网络分析，以进行更深入的生物学解析。
图 4：用不同分析方式对基因进行生物学解析
Step3 针对性分析
在完成基础的细胞类型鉴定后，建议选择特别关注的细胞类型，选择合适的方法和工具，进行有针对性的高级分析和绘图。
1. 拟时序分析：是一种测量单个细胞在生物学过程中进展程度的方法，描述了一个细胞当前状态和时间轨迹的起始状态之间的最短路径，适用于发育生物学中的发育轨迹研究，或者肿瘤微环境中免疫细胞状态的变化研究等。注意，目前该分析仅适用于人和小鼠这两种模式生物。
2. RNA 速率分析：基于可变剪切进行的细胞分化状态分析和预测。通过将测序结果与潜在的 mRNA 剪接动力学联系起来，推断细胞分化的定向轨迹：特定基因的转录(新转录的)导致前体未剪接 mRNA 的增加；相反的，转录的抑制或缺失导致未剪接 mRNA 的减少。
3. 细胞通讯分析：利用单细胞转录组数据分析的细胞通讯的基础是基因表达数据和配体-受体数据库信息，仅限于蛋白质配体-受体复合物介导的细胞间通讯。注意，目前该分析仅适用于人和小鼠这两种模式生物。
4. SECNIC 转录因子及转录调控网络分析：基于共表达和 DNA motif 分析推断基因调控网络，然后在每个细胞中分析网络活性以鉴定细胞状态。
5. InferCNV：拷贝数变异分析，一般用于肿瘤样本的分析。
6. 单细胞 WGCNA 分析：即在高维转录组学数据中进行加权基因共表达网络分析。
图 5：单细胞转录组常见的高级分析
单细胞测序应用解读
1
COVID-19 重症患者
的外周免疫系统单细胞图谱
A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19
期刊：Nature medicine（IF：82.9）
COVID-19 盛行，约 20％ 的患者发展为严重疾病，而 5％ 的患者需要重症监护，迫切地需要更好地了解 COVID-19 的病理生理学。为了说明哪些通路的变化可能引起免疫病理学和保护性免疫的变化，文章对 7 名住院患者（4 名患有急性呼吸窘迫综合征）和 6 名健康人的外周血单核细胞（PBMCs）进行了单细胞转录组测序。作者确定了 COVID-19 感染中外周免疫细胞的重新配置，包括异质干扰素刺激的基因标记、HLA II 表达下调和发育中的中性粒细胞群，在外周血的单核细胞和淋巴细胞中没有表达足够的促炎症细胞因子。
Wilk AJ, Rustagi A, Zhao NQ, et al. A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19. Nat Med. 2020;26(7):1070-1076.
2
HBV 感染不同临床阶段
的肝脏和外周血单细胞图谱
Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients
期刊：Gut （IF：24.5）
我国乙型肝炎病毒（HBV）携带者约有 7000 万例，大量慢性乙型肝炎（CHB）患者需长期乃至终身抗病毒治疗，系统解析 HBV 感染肝脏的免疫特征，有助于开发治疗新策略以提高治愈率。文章通过患者外周血和肝脏配对样的单细胞转录组及单细胞免疫组库分析，深度剖析了 HBV 感染不同阶段的肝脏和外周免疫微环境特点，及 HBV 慢性感染和急性感染中耗竭T细胞的动态变化特点和免疫细胞互作网络。
Zhang C, Li J, Cheng Y, et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients. Gut. 2023;72(1):153-167.
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