流式细胞术虽有万般好，但很多人经常就卡在了令无数新手小白闻风丧胆的第一步：对照设置。有的同学看似辛苦设置了半天，最后发现一个能用的对照都没有；有的压根不知道该设置多少种对照，最后一堆数据砸手里；更有甚者，偷懒觉得不需要设置那么多种对照，最后只能拿着阴阳难分的结果，在导师办公室支支吾吾解释不清……
正确设置流式对照的重要性不亚于完成实验的一双巧手！但是对照种类那么多，也的确经常让人摸不到头脑，为了解决大家这个问题，今天 Bio-Rad 带来超详细流式对照设置说明书，各类对照从作用原理到实验设计轻松掌握！
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空白对照 （Blank Control）
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作用：
（1）帮助确定样本的 FSC 和 SSC 的电压以及样本的分群。如图 1 中，空白对照帮助设置 PBMC 样本的 FSC 和 SSC 电压，并把淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞都展现在图上，不漏掉任何一个细胞群。
图 1 PBMC 的空白对照
（2）可以用于区分背景噪音和样本。
（3）帮助设置每个荧光通道的电压，使阴性细胞群处在合适的位置，为后续更好地调节各个荧光通道的电压做准备。
图 2 使用空白对照调节 SBUV510 和 SBV710 通道的电压
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单染对照（Single Staining Control）
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作用：
（1）帮助调节每个通道的电压，图 3 中利用各个不同颜色的单染，把阳性峰调节到合适的位置。
图 3 Pacific Blue，Alexa Fluor 647，PE 和 FITC 的单染对照
（2）进行自动补偿调节时，需要该实验中的每个荧光通道的单染对照的数据，以进行补偿的计算。
准备单染对照小 Tip：
（1）单染对照的染色结果，必须要阴阳分群明显。全阴性，全阳性或者阴阳分群不明显的样本都不可作为单染对照；
（2）单染样本的荧光素必须与实际样本中的荧光素保持一致，例如 GFP 和 FITC 这两种荧光素是不能相互替换的，因为两者的发射光谱不一致；
（3）补偿对照的染色结果必须与样品亮度相同或亮度高于样品，以模拟实验中的任何荧光溢漏情况；
（4）单染样本应当首选细胞样本，因为电压和背景更接近实际样本，无合适细胞样本时，可用微球代替；
（5）在收集样本时，必须收集足够多的事件，以便在进行补偿的计算时，软件能对荧光的溢出进行统计学显著性确定；
（6）样本中有多少种荧光素，就需要准备多少种单染对照，一个也不能漏掉。
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FMO 对照（Fluorescence Minus One Control）
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作用：
（1）明确荧光通道之间的扩散，方便配色和设门。如图 4 中，PE-Cy5 的 FMO 对照与未染色的样本相比，PE 的荧光扩散到 PE-Cy5 通道中。
（2）当样本的靶标是连续性表达的，阴性和阳性群体区分不开时，需要借助 FMO 来界定阴性和阳性群体。在图 4 中，完全染色的样本中 PE-Cy5 标记的目标抗原表达连续，借助于 PE-Cy5 的 FMO 对照，可以界定阴阳细胞群。
图 4 使用 FMO 对照确定荧光扩散并准确设门。黑色虚线表示 FMO 门控边界，而红色虚线表示未染色边界。
准备 FMO 对照小 Tips：
（1）FMO 对照的样本需与目标样本保持一致；
（2）FMO 对照中除了减一的抗体，其余抗体需要与目标样本组使用同样浓度的抗体。
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同型对照 （Isotype Control）
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作用：
（1）排查抗体与细胞上的 Fc 受体的非特异性结合染色；
（2）排查抗体或荧光素（PE，FITC 等）与细胞成分的非特异性结合。PE-Cy7，PE-Cy5，PE-Dazzle594，APC-Cy7，APC-Fire740 等串联染料偶联抗体时，会对细胞有非特异性染色；
（3）确认染色结果的可靠性。
图 5 Bio-Rad F4/80：Alexa Fluor 647 抗体及其同型对照的信息。
准备同型对照小 Tips：
（1）购买同一厂家的流式抗体和同型对照，保持一致性，因为不同厂家的抗体和同型对照之间，其荧光素和抗体结合的比率可能是不同的；
（2）流式抗体和同型对照使用的浓度需保持一致。
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活性对照
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作用：
区分死细胞和活细胞，确保染色结果的准确性。死细胞具有高水平的自发荧光，并且死细胞能够非特异性地结合抗体。为了避免死细胞引起的结果的偏差，需要加入死活染料来确保结果的准确性。
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生物学对照
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作用：
用已知阴性的样本或已知阳性的样本，来判定实验结果是否可靠。
举例说明：
（1）对于细胞因子刺激实验中，未刺激和完全刺激的样本就是生物学对照。对于确定阳性结果和荧光染色的动态范围以及确认抗体是否按预期发挥作用都很重要。
如图 6 中示例所示，在刺激和未刺激的细胞上对人外周血淋巴细胞进行 CD154 和 CD3 染色。抗体染色的结果与从这些细胞类型预测的染色结果相匹配，表明抗体按预期发挥作用。使用这些抗体，可以将阳性样品与阴性样品区分开，证明抗体具有适当的动态范围。
图 6 使用经刺激和未经刺激的对照。未经刺激或用 PMA 和离子霉素刺激人外周血 5 小时，然后用小鼠抗人 CD3：Alexa Fluor 700（#MCA463A700）和大鼠抗人 CD154：RPE（#MCA1938PE）进行染色。
（2）已知表达目标抗原或缺乏目标抗原表达的细胞，例如已使用 RNA 干扰（RNAi）或 CRISPR 技术敲除抗原而产生的阴性细胞，或者已经被转染并且抗原被过表达以验证阳性染色的细胞。阴性细胞和阳性细胞都是生物学对照。
准备生物学对照的小 Tip：
不同的实验会有不同的生物学对照，需根据具体的实验目的来设置生物学对照。
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注：
1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。
2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
内容策划：潘成
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意