虽然很多细胞生物实验室都擅长免疫荧光实验，但我却是我们实验室做这个的独苗，踩坑无数！一开始的时候，做爬片控制不好细胞密度，很难保证细胞生长在同一层面，最后不是染色不均匀就是脱片了；载玻片也不知道要用明胶包被，清洗的时候组织直接整片 say goodbye，气得导师直接派我去他好兄弟实验室取取经。结果发现人家用的都是一体化的免疫荧光染色载玻片，根本不用操心这些问题。
师姐辣评：「你努力了八百年才到人家起点……」（🤷♀️🤷♀️）
不论你是害怕高难度操作的 IF 新手，还是想省时省力的 IF 高手，今天无差别为大家送上一体化的「培养室-固定-染色-成像」免疫荧光解决方案！
µ-Slide 8 Well high 免费试用！
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无需包被爬片，快速染色无渗漏，节省试剂与细胞。
产品特点：
1. 多种几何形状可供选择，所有免疫荧光染色步骤均可直接在载玻片或培养皿中进行。
2. ibidi 通道载玻片非常适合精确交换少量、中等量。
3. 通道 µ-Slides 的盖玻片底部无需额外的盖玻片。
4. 在 ibidi 腔室载玻片中，带有可移除腔室的硅胶垫圈安装在标准载玻片上，适合长期储存装有盖玻片的样品。
那么，µ-Slide 8 孔独立高壁腔室载玻片是如何在实际科研中进行应用的呢？
现在以粘附的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在 µ-Slide 8 Well high 中培养和免疫荧光染色为例向大家介绍。
💡Tips：在开始免疫细胞化学实验之前，需要检查几个重要参数，例如目标蛋白质的表达水平、最佳细胞密度、合适的细胞培养容器形状和底物/涂层以及确认最佳抗体稀释度。此外，IF 染色必须要有阳性和阴性对照，建议在实验前进行文献查阅调研。
实验主要包括四个步骤
培养室-固定-染色-成像
1. 材料
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1.1.试剂和缓冲液
细胞培养：
• 人脐静脉内皮细胞（HUVEC、C-12203、Promocell）
• 胶原蛋白 IV（354233，康宁）
• 0.05M HCl（X942.1, Carl Roth）
• 细胞培养基：内皮细胞基础培养基（C-22210，Promocell）和内皮细胞生长培养基补充混合物（C-39215，Promocell）
• PBS（14190144，Gibco）
• 精氨酸酶（A1110501，Gibco）
免疫荧光染色：
• PBS（14190144，Gibco）
• 福尔马林，10%，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）
• 抗 α-微管蛋白单克隆抗体（T5168，Sigma Aldrich）
• 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)
• 鬼笔环肽 488 偶联物（ab176753，Abcam）
• 使用含 DAPI 的 ibidi 安装介质（50011，ibidi）
• Triton-X-100（A16046，赛默飞世尔科技）
• 通透缓冲液（PBS 中 0.5% Triton-X-100）
• 封闭缓冲液（PBS 中 1% BSA + 0.2% Triton X 100）
• 抗体稀释缓冲液（1% BSA + 0.05% Triton X 100 的 PBS 溶液）
• 牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G, Sigma Aldrich）
• ibidi 浸油（50101，ibidi）
1.2.设备
• µ-Slide 8 Well high，ibiTreat（80806，ibidi）
• µ-载玻片架（80003，ibidi）
• 标准细胞培养设备（移液器、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数器等）
• 配有滤光片组的倒置荧光显微镜
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2. 方法
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2.1.细胞培养
使用前请阅读说明 µ-Slide 8 Well high，ibiTreat，所有步骤均在无菌条件下操作。在开始实验之前，在标准细胞培养瓶中处理 HUVEC（例如，T75 培养瓶，在 0.05 M HCl 中涂有 6.7 µg/mL 胶原蛋白 IV 处理 1 小时），细胞粘附在底部。
Tips：细胞在实验当天应状态正常且汇合度合适。整个实验应尽量快的完成防止孔变干。如果没有另外说明，所有给定的体积都是按照每一孔，所有的孵育步骤都在室温下进行。
• 用 Accutase 处理培养的 HUVEC 1-2 分钟以进行分离。
• 收集细胞悬液，离心，用少量培养基稀释后进行计数；最终量取决于所需的细胞浓度。
• 计数细胞，在内皮细胞基础培养基和内皮细胞生长培养基补充混合物中，并调整到最终浓度为 2 x 105 cells/mL 。
• 打开 ibidi µ-Slide 8 Well high 的包装并将其放在 µ- Slide Rack 或合适的台面上。
• 每个孔中加入 250 µL 的 HUVEC 悬浮液。
• 盖上随附的盖子。
2.2.固定、通透和封闭
• 为您的实验准备足够的通透缓冲液和封闭缓冲液。
• 使用细胞培养吸液装置从孔中吸出细胞培养基。
• 用 PBS 清洗细胞：将 200 µL PBS 缓慢加入每个孔中轻轻摇晃后吸出。
• 用 200 µL 福尔马林（10%）固定细胞 10 分钟。
• 弃去福尔马林并用 200 µL PBS 洗涤细胞 3 次。
• 将细胞在 200 µL 通透缓冲液中孵育 10 分钟。
• 弃去通透缓冲液并用 200 μL PBS 清洗细胞。
• 用 200 µL 封闭缓冲液封闭 30 分钟。
2.3. 染色和封片
• 在封闭步骤中，准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗。
• 在抗体稀释缓冲液中稀释一抗（α-微管蛋白：1:200 稀释）。
• 加入 150 µL 一抗，孵育 2 小时（请注意，有些抗体需要在 4°C 下过夜孵育）。
• 用 200 µL Blocking Buffer 清洗两次。
• 在相同的抗体稀释缓冲液中稀释二抗和鬼笔环肽（anti-mouse-IgGAtto 594：1:200 稀释度；鬼笔环肽 488 偶联物 1:1000 稀释度）。
• 加入 150 µL 二抗，避光孵育 2 小时。从此时起，样品应尽可能避光。
• 用 200 µL Blocking Buffer 清洗两次。
• 清空所有孔。
• 每孔加入一滴含有 DAPI 的 ibidi 封固剂。
• 避光保存直到成像。最好立即进行成像，放置较长时间可能会降低图像质量
2.4.成像
• 使用合适的滤光片组在荧光显微镜下观察细胞，必要时使用 ibidi 浸油。
• （可选）覆盖图像以创建合并图像。
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3. 结果
对 HUVEC 在 µ-Slide 8 Well high 中免疫染色的宽视场荧光显微镜观察。F-肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽（红色）染色。α-微管蛋白抗体用于染色微管（绿色）。用 DAPI（蓝色）染细胞核。该图为尼康显微镜 60 倍油浸物镜拍摄。
免疫荧光染色是一种灵敏性很高的方法，需要大量的经验积攒和步骤优化。如果 IF 染色未达到预期效果，可按照以下表格进行可能原因的排查。
高背景
低信号或无信号
学到这里是否对自己还没开始的免疫荧光信心满满？正在被不合格免疫荧光结果折磨的同学是否已经跃跃欲试？
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内容策划：潘成
内容审核：朱卿
题图来源：视觉中国