细胞培养做为生物学研究最基础的技术之一，可以说是渗透科研界的方方面面。常有新手小白在细胞房里哀嚎：要么贴壁不牢、要么突然被污染、要么突然「暴毙」……培养细胞细节繁琐，失败率太高，实在让人头秃。
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细胞实验常见问题及注意事项
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细胞复苏注意事项
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1. 从液氮罐中取出细胞时，应做好个人防护以免冻伤；
2. 冻存细胞取出后，如不能立即放入水浴锅中融化，需将其放在干冰上保存转移；
3. 细胞水浴解冻时间以 1 min 内为宜，做到慢冻速融；
4. 已解冻的细胞避免长时间常温存放，需尽快离心去除 DMSO；
5. 刚复苏的细胞贴壁尚不牢固，24 h 内不要频繁观察和换液；
6. 将培养瓶放入培养箱，并将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换（如使用透气性瓶盖，则无需旋松瓶盖）。
细胞传代注意事项
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贴壁细胞
1. PBS 润洗细胞时，从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入 PBS，避免冲刷到细胞层；
2. 不同细胞的胰酶所需消化时间不一样，消化时间根据细胞贴壁特性而定，可每 30 s 观察一次。
悬浮细胞（以 T25 瓶为例）
方法一：
1. 从培养箱中取出培养瓶，轻轻晃动使细胞分布均匀；
2. 吸取 200 ul 细胞悬液计数，根据计数结果进行适当比例传代；
3. 将细胞分装到培养瓶中，加入适量的新鲜培养基，并做好标记；
4. 将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。
方法二:
1. 将细胞悬液转移至离心管中，以 800 r/min 离心 3～5 min；
2. 吸弃上清液；
3. 用 1 ml 预热培养基重悬细胞沉淀，根据沉淀量将细胞稀释，然后分装到培养瓶中，将 10 ml 的培养基加入培养瓶中，并做好标记；
4. 将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。
注意事项：
悬浮细胞需要用未经 TC（Tissue culturetreated）处理的细胞瓶或培养皿培养，如悬浮细胞无碎片，建议按方法一传代。
细胞冻存操作详解及注意事项
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1. 用 50 ml 离心管收集细胞悬液，1,000～1,200 r/min离心 3～5 min；
2. 吸弃上清液；
3. 用预冷的（2～8 ℃）低温冻存液重悬细胞沉淀（建议冻存细胞密度为 1×106～1×107 个/ml）；
4. 将细胞悬液分装到若干冻存管中，并标记细胞名称、冻存时间及操作者。分装时应注意轻轻混合细胞，使其保持均匀的细胞悬液状态；
5. 将冻存管转至程序降温盒并放入 -80 ℃ 冰箱冻存，4 h 后或过夜转至液氮（若使用无血清冻存液则直接放入 -80 ℃ 冰箱，24 h 后转到液氮长期保存）。
注意事项：
1. 选取对数生长期的细胞进行冻存，此时细胞状态比较好；
2. 冻存的细胞不易长期在 -80 ℃ 环境中存储，应尽快转入液氮罐中；
3. 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮中长期保存，为稳妥起见，可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况再继续冻存；
4. 不同冻存液的冻存方式不一样，详见说明书。
细胞实验 10 大常见问题
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1. 如何选用细胞系培养基？
优先根据细胞来源公司提供的培养条件，其次参考 ATCC 推荐细胞对应培养基。一般建议不要随意更换培养基种类。细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用与原先提供的培养条件不同的培养基，可能造成细胞形态发生变化或无法存活，以及细胞的表型功能丢失。
2. 细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接丢弃或更换，将未受污染的细胞转移至其它培养箱，并用消毒剂消毒培养器皿和超净台以及二氧化碳培养箱。如发生真菌霉菌污染，需用紫外灯照射整个细胞间，从而消除可能产生的孢子。同时排除使用试剂的污染，包括培养基和血清，可以空培试验。
3. 为何培养基用一段时间后，颜色偏紫？
培养基随着多次开盖会使培养液 CO2 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性从而变紫，尤其是剩余的培养基越少越容易变紫。可将培养瓶瓶盖旋松放入二氧化碳培养箱校正溶液 PH 值，过一段时间就会变回正常。变紫的培养基是可以继续使用的，培养细胞时在培养箱会自动恢复颜色。
4. 细胞培养液变黄变浑，如何处理？
细胞培养液变黄多半是细胞密度过大，细胞增殖速度过快，产生大量酸性代谢废物，导致细胞营养不足。而培养液变浑多半是发生了细菌污染。出现这种情况应立即进行消化传代处理。
5. 血清中出现的沉淀是什么，有影响吗？
① 纤维蛋白，是经常出现的较大沉淀物，可达到 1～2 mm，用肉眼可观察到；
② 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质，是血清出现沉淀物的常见原因；
③ 磷酸钙，也是一种常见沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在 37 ℃ 培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。
这些沉淀对细胞的生长是没有影响的，如想去除沉淀，尽量采用离心方法，不建议使用过滤方法，因为会堵塞滤膜而且会造成污染的风险。
6. 细胞何时换液最佳？
① 细胞消化传代后，建议隔天或隔两天换一次液；
② 细胞传代后，发现碎片多、死细胞多，在细胞形态已经形成的前提下可第二天换液；
③ 对于生长速度较慢的细胞，可多放点培养基，减少换液次数，让细胞静养；
④ 细胞传代后，细胞分布不均、细胞堆叠、细胞间隙大、局部密度大，这些情况下不用换液，可采取消化重铺的方式。
7. 细胞支原体污染如何处理？
支原体污染是比较难去除的，特别容易复发，一般建议直接更换新的细胞，如特别精贵或重要的细胞可尝试使用四环素、大环内酯类抗生素（泰乐霉素）、喹诺酮类抗生素。
8. 如何控制胰酶消化时间？
胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤。消化过度，细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，导致部分细胞漂浮；消化不足，则细胞难于从瓶壁脱落，反复吹打同样也会损伤细胞活性。
不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。像疏松贴壁的 293T 和 Lncap 可能 1～2 min，正常贴壁的 Hela 和 A549 可能 2～3 min，贴壁较牢的 HEPG2 和 CACO-2 可能 5 min，贴壁非常牢的 5637 和 A431 可能 10 min 左右。具体消化时间以消化到细胞变圆收缩、细胞间隙变大、轻轻晃动培养瓶能看到细胞呈流沙状即可终止。
9. 如何避免血清沉淀物的产生?
① 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20 ℃ 至 4 ℃ 至室温）；
② 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生；
③ 请勿将血清置于 37 ℃ 太久，否则会变混浊，同时许多较不稳定的成分也会因此受到损害，从而影响血清质量。
血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可无须做此步骤。
10. 对细胞形态有疑问？
① 确定细胞所使用的培养基种类是否为说明书建议的。改变培养基种类细胞形态可能会有变化；
② 以引种公司官网细胞照片为准，其次可以参考 ATCC 或 DSMZ 网站的图片；
③ 如上皮型细胞明显成为成纤维细胞，或成纤维细胞明显成为上皮型细胞，需查看细胞是否提供 STR 鉴定报告，身份是否正确；
④ 细胞的代次是否过高导致分化变异、细胞是否经过加药诱导、细胞是否经过转染等都会引起细胞形态发生变化；
⑤ 细胞低密度和高密度形态不一，还有一些细胞呈现形态较慢，细胞要 1～2 天才能伸展开。所以细胞的正常形态要等细胞密度起来后才能确定。
细胞实验操作视频
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内容审核：王丹琦
项目审核：朱卿
题图来源：图虫创意
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