新来的师妹做了一个多月 PCR 实验，条带结果一直不尽人意，连着两周组会都挨了老板批评。想安慰下师妹，结果这周末她居然拜佛去了。
所谓的科研玄学，实验做不出来去拜佛成了当代科研人的选择之一。不过这次得让师妹来拜拜大师兄了！
师妹
师兄，我的 PCR 总失败，要么没条带，要么杂带多、条带不正确。该咋办啊！
我分析了你的引物，设计的不对，容易引起非特异扩增，而且两条引物 Tm 值相差也太大了。我重新教你设计引物吧！
我
师妹
谢谢谢谢师兄！我的救命恩人呐！
你有没有在实际 PCR 实验中遇到小师妹那样的问题？快来看看下面这些问题是不是对号入座了？
常见问题问答：
1.
无凝胶电泳条带的可能原因：
● 反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。
● DNA 胶问题。DNA 凝胶电泳时加阳性对照
● 退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
● DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。
● 引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
● DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净
● 模板有复杂结构。加入 DMSO，BSA 或者甜菜碱。可尝试 Touch down PCR。
2.
PCR 产物量过少的可能原因：
● 退火温度不合适。以 2 ℃ 为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
● PCR 循环数不足。增加反应循环数。
● 延伸时间太短。以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。
● 变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。
● DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净。
3.
有杂带的可能原因
● 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
● 引物退火温度过低。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
● 引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
● 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
● 模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。
● 外源 DNA 污染。确保操作的洁净。
4.
条带弥散的可能原因
● 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。可冰水上准备 PCR 反应体系或采用热启动聚合酶。
● 模板量过多。质粒 DNA 的用量应 < 50 ng，而基因组 DNA 则应 < 200 ng。
● 循环数过多。减少反应循环数至 30。
● 引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。
● 引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
5.
阴性对照出现条带的可能原因
● 检查试剂，枪头，工作台是否存在污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6.
条带大小与理论不符的可能原因
● 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
● 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
● 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。
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寻找那些年一起用过的 PTC
看到了这些多实验技巧和 troubleshooting，是不是你心中也涌起一种冲动，有 PCR 实验的经验想要分享呢。
正好近期 Bio-Rad 已经广发英雄帖，正在诚邀各位 PCR 高手分享自己的独家 PCR 秘籍，参与下面的征集活动就能把iPadipad、APPle Watch、Airpods 等大奖拿到手～
心动不如行动，快拿起你那做 PCR 实验的小手儿扫描下面的二维码～
谨以此次活动怀念那些难忘的实验时光，挥洒的青春汗水，以及那些年我们一起用过的 PTC～
活
动
详
情
参与对象
● 中国大陆地区使用过或正在使用 PTC 系列热循环仪的科研人员
● 此次活动不含临床医疗机构
活动奖品
评奖规则及作品要求
● 参赛作品按 Bio-Rad 评选委员会的打分从高到低进行排序，前 100 名有资格获得相对应的奖品。
● 如有同一个参赛者提交多个作品，则以分数最高者为准。
● 作品主题：作品需与 PTC 热循环仪、PCR 相关实验流程以及 PCR 凝胶电泳结果有关，图文或视频形式均可，并填写简要的作品描述（如新老 PTC 仪上 PCR 结果的比较、开展 PCR 实验的经历、实验技巧、troubleshooting 经验分享等等）。
● 参赛作品需以凝胶电泳结果为基础，并提供证据（如仪器运行照片）以证明是在 PTC 系列热循环仪上完成。
● 加分项：提供 PCR 实验细节、特色应用（基因编辑、甲基化、NGS、整合到自动化流程中等等）、已发表的文章等等。
● 参赛作品需确保原创。
活动流程
参赛注意事项
● 参赛区域为中国大陆地区
● 若发现用户并非 PTC 系列（含 PTC Tempo）的真实用户，将取消用户参赛资格
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PCR 实验，因 PTC 而精彩～
注：
1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。
2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
内容策划：邹礼平
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意