TRIzol 提取 RNA 虽然基础，但实验结果真的几家欢喜几家愁，失败的场景总是在睡前反复重播。
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谁懂啊，最大的内耗居然是自己！提个 RNA 基本就是盲区狂踩雷而不自知。师兄说 RNA 质量和浓度很大程度决定于 TRIzol 的使用，它是影响实验结果的关键之一！今天带大家从原理到实操一步步详细学习如何使用 TRIzol 提取 RNA，再小的坑也不踩！
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从原理说起：万千试剂，提 RNA 为何用 TRIzol？
1977 年，德国科学家 Axel Ullrich 和他的同事们提出使用异硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）用于 RNA 的分离纯化。1987 年，Piotr Chomczynski 和 Nicoletta Sacchi 使用了改良的硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取法提取得到样本中的总 RNA。在 1990 年，优化该方法后，推出商业化的 TRIzol 试剂。
TRIzol 试剂进行样本匀浆化后，不但可以破坏细胞，溶解细胞组分，同时还可高效的抑制 RNA 酶的活性，维持 RNA 的完整性。同时 TRIzol 试剂允许按顺序沉淀单一样本中的 RNA、DNA 和蛋白质 （Chomczynski，1993）。
TRIzol 试剂像一把被无数匠人精心打磨过的利剑，帮助科学家们在充满困难的探索之路上披荆斩棘。那么我们在使用 TRIzol 时又有哪些注意事项呢？
TRIzol 使用必学小妙招，你也能被导师赞不绝口
接下来跟着实验操作，学习必须「收藏 + 转发 + 点赞」的「TRIzol 使用 6 个小妙招」！
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准备阶段：
1. 确保实验环境无核酸酶污染，可以使用 RNaseZap™ RNase 去污溶液（货号 AM9780）去除实验台表面和非一次性物品。
2. 实验过程中，请使用一次性手套和不含核酸酶的一次性枪头和离心管，防止引入核酸酶污染。
3. 准备好相应的实验材料：
a. 提取 RNA：异丙醇，乙醇（75%），0.5% SDS 溶液。
b. 提取 DNA：乙醇（100%），乙醇（75%），0.1 M柠檬酸钠溶于 10% 乙醇，8 mM NaOH，HEPES。
c. 提取蛋白质：异丙醇，乙醇（100%），含 0.3 M 盐酸胍的 95% 乙醇，1% SDS 溶液。
tips
实验环境和实验用品的核酸酶污染是导致 RNA 实验失败的重要因素，做好核酸酶清除工作，使用无核酸酶的实验用品，可以让我们实验事半功倍哦！
实验步骤：
裂解样本
1. 根据不同样本材料在 TRIzol 试剂中裂解并匀浆化样本。
a. 组织：每 50～100 mg 组织加入 1 mL TRIzol 试剂，用匀浆仪对样本进行匀浆化。
b. 单层培养细胞：移除培养基，每 1×105～107个细胞加入 0.3～0.4 mL TRIzol 试剂，反复吹打匀浆化样本。
c. 细胞悬液：离心后弃除上清液，收集细胞，每 0.25 mL 样本加 0.75 mL 的 TRIzol 试剂，反复吹打以匀浆化。
tips
1）在 TRIzol 试剂中可以防止 RNA 降解，故加入 TRIzol 试剂前，不要洗涤细胞。
2）样本体积不应超过用于裂解的 TRIzol 试剂体积的 10%。
2. 孵育 5 分钟，随后每 1 mL TRIzol 试剂添加 0.2 mL 氯仿，盖紧盖子，剧烈混匀。孵育 2~3 分钟。4℃ 下 12,000×g 离心 15 分钟。
3. 此时混合物分离成为三层，如下图，我们需要将对应提取部分吸出进行后续操作。
tips
Invitrogen™ Phasemaker 分层管（货号：A33248，A33249）可在 TRIzol 混合物样品的水相和有机相间形成一层牢固可靠的胶封，使科研人员能够轻松移取 RNA 相。
RNA 提取
1. RNA 沉淀：取尽上层水相，每 1 mL TRIzol 试剂加 0.5 mL 异丙醇。4℃ 孵育10分钟。4℃ 下 12,000×g 离心 10 分钟。此时底部的白色胶状沉淀即为总 RNA 沉淀。弃上清液。
2. RNA 洗涤：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂，用 1 mL 75% 乙醇重悬沉淀。瞬时漩涡震荡，在 4℃ 下 7,500×g 离心 5 分钟。弃上清，RNA 沉淀在空气中干燥 5～10 分钟。
3. RNA 溶解：用 20～50 μL 不含 RNase 的水，0.1 mM EDTA 或 0.5% SDS 溶液，反复吹打重悬沉淀。在 55～60℃ 孵育 10～15 分钟，然后继续下游实验或者 -70℃ 长期保存。
tips
1）如果起始样本很小（< 106 个细胞或 < 10 mg 组织），请将 5～10 μg 不含 RNase 的糖原作为载体加入到水相中，这样有助于促进 RNA 沉淀。
2）如果 RNA 会在随后的酶促反应中使用，则切勿将 RNA 溶解在 0.5% SDS 溶液中。
DNA 提取
1. DNA 沉淀：完全弃除上层水相，剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂添加 0.3 mL 100% 乙醇，盖紧管盖，反复颠倒混匀。孵育 2～3 分钟。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，沉淀 DNA，移除溶有蛋白质的上清液。
2. DNA 洗涤：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂加 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 柠檬酸钠（pH 8.5）重悬沉淀。孵育 30 分钟，偶尔轻轻颠倒混合。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，弃上清液。重复洗涤步骤一次。对于 DNA 含量较大的样本（＞ 200 μg）可以重复洗涤步骤两次。每 1 mL 用于裂解的TRIzol试剂加入 1.5～2 mL 75% 乙醇重悬沉淀，孵育 10～20 分钟，偶尔轻轻颠倒混合。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，弃上清液，沉淀风干 5～10 分钟。
3. DNA 溶解：用 0.3～0.6 mL 的 8 mM NaOH 上下吹打重悬沉淀，4℃ 下 12,000×g 离心 10 分钟，转移上清至新管子中。加 HEPES 调整 PH 用于下游应用或用 HEPES 和 1 mM EDTA 调节 PH 至 7～8 长期存储于 -20℃。
tips
干燥 DNA 的时候，不要用真空离心干燥，会影响 DNA 质量以及后续 DNA 溶解。
蛋白质提取
1. 蛋白质沉淀：完全弃除上层水相，剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂添加 0.3 mL 100% 乙醇，盖紧管盖，反复颠倒混匀。孵育 2～3 分钟。4℃ 下 2,000×g 离心 5 分钟，沉淀 DNA。上清转移至新管中，每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂加 1.5 mL 异丙醇，孵育 10 分钟。在 4℃ 下 12,000×g 离心 10 分钟，弃上清液，留蛋白质沉淀。
2. 蛋白质洗涤：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 试剂需要加 2 mL 的含 0.3 M 盐酸胍的 95% 乙醇至沉淀中，孵育 20 分钟。在 4℃ 下 7,500×g 离心 5 分钟。弃上清液，沉淀在干燥空气中静置 5～10 分钟。
3. 蛋白质溶解：加入 200 μL 1% SDS 溶液，反复吹打重悬。4℃ 下 10,000×g 离心 10 分钟，将上清转移到新管中。检测蛋白质浓度并用于下游应用或者长期存储与 -20℃ 中。
tips 
蛋白质溶解步骤中的重悬，在 50℃ 水浴或者金属浴中孵育，有助于沉淀重悬充分。
学习结束，有的同学会说，原理操作我都烂熟于心了，这 RNA 我还是提不好是为什么呀！很有可能问题不出在你，出在山寨 TRIzol 身上！接下来就教大家辨别，看看你买的 TRIzol 试剂真不真。
真假 TRIzol 试剂这样区分超轻松，从此告别当冤种
1
TRIzol 试剂的瓶子大小一般是确定的，如果发现瓶子大小形状和以往购买的不同，则有可能是假货。
2
TRIzol 试剂的标签一般是固定的，条码字体等印刷都是清晰的，如果发现标签形式和以往购买的 TRIzol 不同，标签上印刷粗糙，则很有可能是假货。
3
如果您发现反复试验，得出的结果依然非常不理想，甚至导致实验失败，请注意您可能购买到了假货。
4
TRIzol 试剂的批号在官网都可以查到，如果您购买的试剂，批号在官网查不到，或者在官网查到后发现其他信息如生产日期等和实际不符，您很有可能购买的是假试剂。
5
为了避免购买到假试剂，请选择从赛默飞官网或者赛默飞指定经销商处购买 TRIzol 试剂。如果购买到了假试剂或者对您购买的试剂有疑惑，请及时和我们联系。您可以拨打赛默飞客户（生命科学产品客服电话：800-820-8982 或 400-820-8982）反映情况。如果确认假货，请联系代理商退货，并选择官方渠道购买。
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正所谓「冰箱满满，试剂在手，实验无忧」，为了助力科研 er 顺利开启新学期，赛默飞如火如荼展开「开学季促销」活动：
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福利二：留言互动赢好礼
分享你和 TRIzol 的故事，赢好礼。在提取 RNA 的漫漫长路上，很多小伙伴都得到过 TRIzol 的陪伴。那么，你还记得你第一次用的 TRIzol 产品是提取什么样本？有没有遇到什么困难？提取的效果如何？有没有什么有趣的故事？
欢迎文末留言，分享你和 TRIzol 相伴相识的故事。截止 2023 年 8 月 24 日 17 点，点赞前 3 位可获得罗技无线轻音鼠标，点赞数排名 4～10 位可获得乐扣随手杯！
内容策划：王丹琦
内容审核：吴军
题图来源：图虫创意
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