
PCR 反应体系,Taq 酶的选择、循环参数的设定是常见问题。比如:
如何设置循环参数?
PCR 反应体系如何设置最标准?
本文,我们汇总了「PCR 反应体系与反应条件、Taq 酶的选择、循环参数的设定」等问题,一定可以解决你的困扰。
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「进阶」
PCR 体系搭建注意事项
1、酶的选择
建议综合考虑保真性、扩增速度、操作简便性、价格等衡量因素选择合适的 DNA 聚合酶。此外,过高的温度以及过长的时间对 DNA 聚合酶的活性都有影响。
2、变性温度不能过高
会影响酶的活性,变性温度低,解链不完全,导致引物不能结合,得不到扩增产物;
3、退火温度
建议与引物的 Tm 值有关,退火温度一般设置为 Tm-5;
4、循环参数
依据实验目的而定,一般的检测质粒构建是否成功,20~24 个循环就可以;而对于构建过程获得 PCR 产物来说一般 28~34 个循环左右。循环数太小,获得的产物不够,循环数太多浪费时间,产物的特异性也不一定好,不是循环数越多越好。
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