最近开始了新课题，本已熟能生巧的 qPCR 实验开始变得很不稳定：特异性差、灵敏度低、结果重复差、qPCR 扩增曲线异常、CT 值偏大等。
雪上加霜的是，这次细胞样品很珍贵（动物组织、肿瘤、干细胞等稀少样本），无法一次性进行多基因表达分析，不是 RNA 提取量少就是 RNA 质量不佳，甚至没有足够 cDNA 模版进行 qPCR, 不巧遇到多个低丰度表达基因，整个课题举步维艰。
其实，不管是经验丰富、受过专业训练的科研工作者还是初入科研领域的小白，使用 qPCR 分析珍贵样本, 想要获取多基因表达,兼顾灵敏度和重复性高都会遇到千奇百怪问题。
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详细操作秘诀和福利
伯乐本秘籍专解决以下研究瓶颈:
1. 样本珍贵稀少且取得不易, 欲针对多目标基因表达分析；
2. 显微切割后小鼠肿瘤或单细胞样本；
3. RNA 提取损失严重；
4. 起始样本量有限 cDNA 模版不足；
5. 目的基因表达水平极低。
一位来自多伦多 Lunenfeld-Tanenbaum 研究所的 Mark Kibschull 博士就遇到和上述情况类似的实验困境，他是怎么处理的呢？
小小的 qPCR 实验，大大的能量
Mark Kibschull 博士的课题聚焦于利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells， hESCs），为了更好地了解 hESCs 如何发育成构成人体的 200 多种特殊细胞类型，需要不断优化 hESCs 的培养条件以确定诱导这些干细胞分化成多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的生化线索。
该如何评估培养条件的改变对干细胞分化的影响呢？利用简单基础的荧光定量 PCR 实验，获得不同培养条件下的 hESCs 的基因表达谱，进而鉴定 iPSC 即可达到实验目标。理论上，这是一项简单的任务，但事实证明，这是一个几乎无法克服的挑战。
简单的 qPCR 实验，其实暗藏玄机
hESCs 在特殊的培养板和培养条件下，会聚集成球状结构---类胚体（embryoid bodies，EB，图 1 所示），经过几周的培养可能只剩下 10 或 20 个类胚体，若用柱式法提取高质量的 RNA 至少需要 30～50 个类胚体！样本珍贵稀少、RNA 质量差、多个目的基因低丰度表达成了遏制实验进程的三大痛点。
图 1. 类胚体，显微镜下的干细胞聚集成三维结构并诱导分化
让人头秃的是，限于时间、人力和经费成本，通过多培养一些 hESCs 来增大样本量以提取 RNA，是行不通的。
治标又治本，量身定做解决方案
样本量太小，常常限制了可以解决的问题。Bio-Rad为科研人量身定制了一系列试剂，样本即使少到 100 个细胞，1 个 EB 或 iPSC 细胞团照样能分析基因表达谱。流程很简单（如图 2 所示）：直接裂解细胞(不需过柱纯化 RNA,避免 RNA 损失)且同时去除基因组 DNA；高通量专门反转录试剂盒提升 cDNA 模版合成量；特异目的基因预扩增；qPCR 实验分析结果。
图 2. 新的 qPCR 流程使得 Mark Kibschull 博士用 100 个细胞就可以分析成百上千个基因的表达谱
应用解决方案:
基因表达分析工作中常面临的一个共通性问题：珍贵样本太小，限制可以分析的基因数据通量, qPCR 的灵敏度受样本制备、逆转录或扩增效率影响。因不同次的 cDNA 合成或扩增, 都可能造成实验重复性差,同一批样本相同基因表达结果不一至。
下面图示重点介绍 Bio-Rad 全流程解决方案 (内含 protocol)
图 3. Bio-Rad 全流程解决方案
如果遇到类似细胞样本珍贵极少, 限于经费和人力难以解决问题的同志们不妨来试试 Bio-Rad 的试剂，识别下方二维码即可获取详细全流程解决方案 Protocol，还有您想象不到的促销福利和咨询方式
高通量专用 iScript™ Advanced cDNA 逆转录试剂盒主要特点 (cat1725038)
扩大qPCR数据通量和性价比
单次 20 µl RT 反应可最大化加入 7.5 µg RNA 以产生更多 cDNA 模版。
减少测定间差异并提高重现性
消除多次 cDNA 合成反应的需要；
检测低水平目标基因
当 RNA 样本有限时，即使使用较少的输入 RNA，也能获得不受影响的灵敏度；
真实呈现目标 mRNA 水平
RNase 抑制剂的有效混合物可防止反应设置和 RT 过程中 RNA 降解；
提高引物设计灵活性并防止 5' 和 3' 偏差
寡聚 (dT) 和随机引物的最佳混合，可实现卓越的 RNA 覆盖率；
操作简易反应快速
2 管试剂盒在 21 分钟内生成 cDNA。
内容策划：王丹琦
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意
注：
1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。
2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
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