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PCR 是一个坑，埋了好多研究僧……
PCR 实验中常遇见一些令人头疼的小问题，可能就是实验设计或者实验过程中一个小小的条件没有到位，就导致预期的实验结果出不来。
PCR 总是 P 不出，往往有 3 个原因，来看看究竟是哪一环节出了错吧。以下内容来自丁香实验「PCR 专题」，超全 protocol 经验总结图文不断更新，建议点击收藏！
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样本制备你的 RNA 样本合格吗？常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，这两个方法各有所长，但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。
因而，提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常，在 260，280，230 nm 处分别测定其吸光度（A260、A280、A230）并计算其比值（A260 /A280，A260 /A230）。
230/260/280 究竟有何意义？
A260 为核酸的吸光度，A280 为蛋白质的吸光度，A230 为其他杂质（多糖等）的吸光度。纯 DNA 的 A260 /A280 为 1.8，纯 RNA 的 A260 /A280 为 2.0。
如果 OD 比值不在范围内该如何解决呢？
再次洗涤样本！
75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗涤；若采用 TRIzol 法提取 RNA，可直接洗涤两次。洗涤后离心时可两次分别将 EP 管置于不同的方向，便于彻底洗涤 RNA 样本。通常洗涤两次后可使测得的 OD 值较为理想。
引物特异性太差试试这个免费软件提到 PCR 老是 P 不出，大部分同学都会觉得是引物的锅。
引物，是进行 PCR 实验的必备条件。其特异性的问题可通过「BLAST」搞定，让人比较头痛的是引物可以形成「发夹结构」或「二聚体」（即在＜75℃ 时出现溶解曲线的峰），影响扩增效率，最终导致实验结果不可用。
那么，这个问题能否解决呢？
有！设计引物的时候用「RNAstructure」预测一下引物的二级结构即可。
那么，这个软件要如何使用呢？文章篇幅有限，大家可以点击下方卡片查看全部教学内容👉 点此查看软件教学
最后一步保证扩增效率好多同学反馈：同一批样本、同一批引物、甚至都用一起配的胶了，P 出来的结果依旧不！一！样！真的很崩溃，但这其实不是操作者的问题。
不知道各位看官有没有遇到类似的问题？先说说出现这类问题的原因吧：
1. 扩增条件非最佳；
2. 样本中含有抑制扩增的物质，如乙醇。
一对引物有其特定的 Tm 值，但 Tm 值时未必是其最佳扩增温度。温度过高时，扩增效率过低，差异部分的目的基因不能被扩增，导致「假阴性」结果的出现。那么，如何确定扩增效率是否满足要求呢？
通常，拿到新引物后应从 Tm- 5℃ 寻找其适宜的扩增温度，在某温度起为特异性扩增。
然后，在特异性扩增的温度下检测扩增效率：将 cDNA 梯度稀释（一般为 2×），测试稀释后的样本 Ct 值差异是否为 1 左右。
1、若差值为 1，则扩增效率良好，可进行正式实验。
2、若在特异性扩增的温度范围内不能使 Ct 值差异为 1，则需考虑重新设计引物。
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