免疫染色又失败,这样的 bug 你经历过多少?自查表送上

2023-06-26 20:32 来源:微信公众号 - ShengWuXueBa 作者:生物学霸
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免疫染色虽然原理简单,但步骤复杂,经常忙活一整天,结果却不尽人意:切片出现脱片、染色结果为阴性、组织切片出现非特异性染色、染色背景过强、切片染色不均匀、拍照啥也看不见……


但其实我们在进行问题原因排查时,按照样本制备、抗原修复、抗体检测、成像四步走,就可以排除大部分问题!按照下面的自查表来看看你的 IHC 结果不满意是不是因为没注意这些点吧!


样本制备


无染色或染色弱

切片是否过于成旧?玻片上的组织是否已干化?脱蜡是否正常?


高背景值

洗涤与固定是否充分?组织是否有人为或试剂损伤?检测试剂是否渗透完全?


抗原修复


无染色或染色弱

固定步骤引起的抗原交联导致未被修复


抗体结合


无染色或染色弱

一抗二抗是否失活?一抗是否为同种型且适用 IHC 应用?抗体稀释度是否合适?二抗是否浓度过高或无法提供足够的信号放大?


组织内目标蛋白丰度低或没有?目标蛋白是否为无法检测的核蛋白?


高背景值

一抗二抗是否有非特异结合?是否使用了同一物种的抗体?是否有多克隆抗体或者抗体浓度导致的非特异结合?


孵育温度是否过高?底物浓度过高?


成像


无图像

染色步骤是否确认无无误?


光源是否设置正确?是否正确聚焦?滤光片是否正确调整?


图像不正常

物镜是否干净?图像是否存在光学像差?样品中是否有发射光谱重叠?封闭剂和色原与盖玻片是否兼容?

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不难看出,在 IHC 实验中选对抗体实验就成功了一半!除去 IHC,还有一系列实验中抗体是影响成败的关键因素!


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为什么抗体的批次稳定性难以维持一致?默克抗体又有哪些优势?


原因要追溯到传统抗体生产技术的原理,抗体储存条件不当或者抗体靶标复杂异常都会导致抗体的特异性差,但抗体结合特性同样受到生产和纯化工艺相关的许多因素制约。想知道有哪些因素导致抗体不稳定,需要先了解各类抗体的生产过程和作用模式。



多克隆抗体的生产


多克隆抗体直接从通过免疫动物后的血清中产生和分离,流程相对简单,速度快且成本低。多抗可以识别抗原的多个表位,灵敏度更高。多抗无表位被掩盖的顾虑,在检测翻译后修饰或结构异质化蛋白时具有一定优势。


大多数多抗产自于兔子体内,是因为兔物种对抗原的免疫反应较强。然而,多抗有时会引入较高的背景信号,不同制备批次间易存在差异,导致实验结果不可重复。



单克隆抗体


杂交瘤技术将宿主免疫产生的 B 细胞与永生骨髓瘤细胞融合,筛选获得的杂交瘤细胞能够在培养中持续生长,表达对抗原单一表位具有特异性的抗体,并在一定时间内保持抗体的稳定性能。适合于特定结构域或特定修饰的特异性检测


大多数单抗产自于小鼠体内,是因为小鼠物种免疫的特异性较强。然而杂交瘤细胞系在经过长期培养后,可能出现细胞系漂移或返祖现象,不分泌特异抗体或者抗体效价降低。



既然兔多抗和鼠单抗各有各的优点,有没有一种抗体可以集合二者优点,又摒弃二者的缺点呢?我们全都要!


重组抗体


通过基因克隆技术,将携带抗体基因序列的载体引入表达宿主(如细菌、酵母或哺乳动物)中,用于生产高质量的功能性抗体。


重组抗体性能稳定,几乎没有批间差异,并且生产过程不需要动物,既避免动物病原体污染,也减少了对动物的伤害。






重组抗体技术平台,ZooMAb® 重组单克隆抗体平台,荣获 2020 年度 CiteAb 创新产品奖


技术革新:新一代 B 细胞克隆技术


ZooMAb® 重组抗体平台基于独有的专利技术,从免疫宿主的外周血单核细胞中分离大量 B 细胞并永生化,效率可达 80~90%,因此可以获得大量阳性克隆,并赢得足够的时间来进行筛选与鉴定,获得兼具高灵敏度、高特异性、高批间稳定性的优质抗体



工艺升级:冻干粉


ZooMAb® 抗体经过浓度预校准,每支抗体的浓度相同,确保实验方案的稳定性。ZooMAb® 抗体以冻干粉形式提供,可在环境温度下进行运输,不需要干冰和低温冰箱。冻干粉抗体储存于 1.6 ml 管中,管盖包含防蒸汽的 O 形环,密封效果好,可长期稳定保存。


应用验证:至少 3 种


通过多重筛选获得高亲和力、高特异性的克隆,同时每种抗体至少经过 3 种以上常见应用验证,如 WB,IHC,IF,ELSIA 等,一支优质抗体解决多种应用需求。


成本降低:性价比高


ZooMAb® 抗体利用重组表达技术生产,生产成本相较免疫动物纯化抗体低,且产量稳定可靠。是市面上性价比相对高的抗体生产平台。


内容策划:潘成
内容审核:邱天天

图片来源:默克生命科学

题图来源:视觉中国


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编辑: 王凯

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