一周一次的组会上，师兄师姐因 qPCR 怎么优化「吵了起来」。起因是师妹的海马样本「危在旦夕」，但是 qPCR 数据一直不给力，究竟怎么才能让实验快速推进？（文中含惊喜福利
）
小组组会
上午 11:10
师兄师姐，我把反应体系的 10 微升换成 20 ，会不会更稳定？
大师姐留的笔记本上都写了，扩增曲线不稳定，1 要提高模板量，2 要提高循环数。优化这两步才是最稳妥的！
但是师妹的海马样本珍贵没有备份了，我觉得用 plan B ,优化试剂、仪器等「qPCR 硬件」更有必要！
先别吵，扩增曲线不稳定可能是 cDNA 纯度低，也可能是体系中存在较多杂质的问题。师妹的样本确实不多了，我同意师兄的建议，咱们先优化预混液试试，或许能解决问题。
其实优化 qPCR 不仅只有 Plan A。本文整理了大部分人都会忽略的几个 qPCR 优化「方案」，给到 Plan B 。另外，赛默飞新推出的重磅新品预混液：Applied Biosystems™ 乾坤™ 白金™ SYBR™ Green 预混液，检测特异性灵敏度高、批次间结果稳定、桌面稳定性高，适用于复杂样本。强强结合！让你的 qPCR 实验有更多保障。
现在扫描下方二维码或点击「阅读原文」参与有奖调研，即有机会获赠小米电吹风（限量 30 份）、恩谷 LED 护眼台灯等（限量 40 份）等精美好礼；我们也将在提交问卷的用户且经确认为有真实有效需求的用户，每人赠送乾坤白金 SYBR Green qPCR 预混液试用装及罗技无线鼠标礼品一份。试用后反馈实验数据及结果，即获赠精美礼品：罗技无线蓝牙键盘一份，样本再「复杂」也能做好 qPCR 实验。
填写问卷，赢好礼
3 个 qPCR 经验误区要警惕
误区 1
扩增曲线不好，只优化 cDNA 量
扩增曲线不稳定时。很多人认为是 RNA 纯度低或者反应体系中存在较多杂质引起的。主要会从高纯度的 cDNA，小心操作防污染等步骤进行优化。
扩增无法达到平台期时。很多 qPCR 老手，第一时间认为是模板浓度太低；循环数太少。解决方案也会从提高模板量，提高循环数进行。
但其实扩增曲线异常，也可能是仪器问题、试剂扩增效率低等「硬件」问题。因此，仪器进行校准、提高镁离子浓度，换用扩增效率高的试剂也很重要。好的仪器设备与 qPCR 预混液，可以让你在复杂样本中，得到高质量的扩增曲线。
误区 2
熔解曲线异常，只有引物二聚体背锅
一旦熔解曲线出现双峰，较低峰 Tm 在 80 ℃ 之前，实验老手会第一时间怀疑，是否是因模板浓度过低或引物浓度过高使多余引物形成了引物二聚体。解决方案一般会锚定在：适当提高退火温度、提高模板量、降低引物浓度、重新设计引物等等。
如果出现严重双峰，Tm 都在 80 ℃ 以后，可能是引物特异性过差，建议 BLAST 检查引物特异性，重新设计引物。
其实除了以上常规操作，也有可能是反应体系被污染，建议在无模板洁净区内配制体系，谨慎操作每一步，或者使用优质预混液更能兼容复杂样本。
误区 3
批次间重复性差，一定是污染或者降解？
一次准确的 qPCR 数据，可能会来自多次试验验证，我们在进行多次实验的时候，常出现批次效应，重复性差等情况。很多科研人会觉得是 cDNA 降解或者污染了，其实可能是反应体系的问题，其中部分试剂质量不稳定，批次间存在差异导致的。
<<<往左滑动，查看更多 >>>
实验预混液能反应体系质量的重要标准！一份合格的实验预混液能让实验事半功倍。赛默飞新品乾坤白金 SYBR Green 预混液，高灵敏度、高特异性、超强荧光信号、质量优、批次稳定，是您 qPCR 的不二选择！现点击「阅读原文」填写简单问卷，即可免费申请试用。
优势一：灵敏又特异，扩增曲线更稳定
乾坤白金 SYBR Green 预混液含有 Taq DNA 聚合酶，专为在最具挑战性的实时 PCR 应用中实现卓越性能而设计，具有高灵敏度（5 Copies）和特异性。
乾坤白金 SYBR Green 预混液为各种各样的靶标提供了最大的灵敏度和特异性。乾坤白金 SYBR Green 预混液从 10 ng cDNA 扩增
（A）SC100A11（高表达，高 GC 含量（～70%））
（B）WISP3（低表达，低 GC 含量（～37%））
（C）ACADVL（长扩增子，200 b.p.）
优势二：超强荧光信号，数据「干净稳定」
乾坤白金 SYBR Green 预混液持续发出强烈的荧光信号，远高于背景，从而产生干净而稳健的结果。与其他预混液相比，在放大的平台阶段的正信号亮 2 倍以上。
乾坤白金 SYBR Green 预混液与其他主混合物相比，提供了最强的荧光放大信号和最高的 dRn 值。
（A）所示为每次反应从 0.1～10 ng cDNA 扩增 SC100A 的代表性扩增图。
（B）乾坤白金 SYBR Green 预混液扩增平台阶段的荧光（即循环 40 时的 ΔRn）高出其他供应商 2 倍以上。使用用于 RT-qPCR 的 Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒（#K1642）从通用人类参考 RNA 产生 cDNA。实时 qPCR 反应采用快速模式在 QuantStudio 5 实时 PCR 系统上进行。
优势三：宽动态范围，兼容更多样本
乾坤白金 SYBR Green 预混液可以产生多达 7 个动态范围的对数（见图），并且与其他预混液相比，在检测各种目标时显示出等效或更好的动态范围。
乾坤白金 SYBR Green 预混液与其他供应商的预混液相比，具有最大的动态范围和最高的线性度和特异性。
每个反应从 1e-5 到 10 ng 的 cDNA 扩增 RPLP0。对扩增产物进行熔融曲线分析以评估特异性。使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒（#4368813）从通用人类参考 RNA 产生 cDNA。所有实时 qPCR 反应均采用快速模式在 QuantStudio 5 实时 PCR 系统上进行。
优势四：桌面稳定性高，室温 72 小时「保质」
乾坤白金 SYBR Green 预混液经过设计，可在室温下制备的反应中保持高水平的性能长达 72 小时。下图显示了在制备时（T0）和在室温下培养 72 小时后（T72）进行的反应的稳定性
乾坤白金 SYBR Green 预混液 72 小时的桌面稳定性。从 1 ng 人 cDNA 中扩增出 6 个人类基因靶标（AHCTF1、B2M、CD44、NOLA3、RPLP0 和 UBC）乾坤白金 SYBR Green 预混液在反应设置（T0）后立即和在室温下在黑暗中孵育 72 小时后（T72），ct 值几乎无变化。在这两个时间点对这些测定的单熔体曲线进行了确认。使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒（#4368813）从通用人类参考 RNA 产生 cDNA。实时 qPCR 反应采用快速模式在 QuantStudio 5 实时 PCR 系统上进行。
优势五：批间一致性高，数据重复性好
乾坤白金 SYBR Green 预混液遵循 ISO 9001 质量管理体系，有助于确保生产过程的可追溯性，并建立从原材料采购到产品生产的质量控制点，有助于生产高批次一致性和稳定的预混液重复性
乾坤白金 SYBR Green 预混液具有很高的批次间一致性和稳定的重复性。
（A） 使用三个批次乾坤白金 SYBR Green 预混液从 1 ng cDNA 扩增人基因靶点 RPLP0（每批 n = 32）。对于所有的反应（n ＝ 96）产生了单熔体曲线。
（B） 从 cDNA 的倍比稀释系列，一共 11 个稀释点中扩增 RPLP0（每个稀释点 n = 32）。使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒（#4368813）从通用人类参考 RNA 产生 cDNA。实时 qPCR 反应采用快速模式在 QuantStudio 5 实时 PCR 系统上进行。
优势六：抗残留污染，实用性更胜一筹
在抗污染方面，乾坤白金 SYBR Green 预混液还能做到抗残留污染，预混液中加入了尿嘧啶脱氧核糖核酸糖苷酶（UDG）和 dUTP，能够降解任何先前扩增的 PCR 产物，有助于防止后续 qPCR 反应的污染和可能的假阳性。
（上下滑动查看）
灵敏、特异、稳定、高效！这就是乾坤白金 SYBR Green 预混液，是科研用户、生物医药应用和分子诊断的理想选择。点击「阅读原文」免费申请试用，别再让样本、反应体系左右你的 qPCR 实验进度啦！
乾坤白金 qPCR 预混液首单礼
活动时间：2023 年 6 月 1 日～2023 年 6 月 30 日
活动规则：活动期间（2023 年 6 月 1 日～2023 年 6 月 30 日），用户在掌上赛默飞（含现货供应中心）、赛默飞官网完成首次订购乾坤白金系列 qPCR 预混液任意产品（见下表），可获得一次领奖机会，小米养生壶/蕉下胶囊伞/星巴克浮雕杯（礼品三选一），每个注册账户每个活动期间仅限参与一次。
扫码去购买
请扫描上方二维码进入掌上赛默飞乾坤白金专属页面进行采购，乾坤白金 qPCR 预混液首单礼可通过扫描下方二维码申领。
扫码申领首单礼
内容策划：邹礼平
内容审核：吴军
文中图片来源：赛默飞
题图来源：图虫创意
点击「阅读原文」，立即参与活动！
