这几年的科研圈子里，类器官堪称「顶流」，它能够最大程度地模拟体内组织的结构、功能，并能长期稳定传代培养，因此，在再生医学、精准医学、药物毒性等基础研究和临床应用上都被广泛应用。
不夸张的说，类器官培养一技在手，天下我有。
由于类器官的构建，常常伴随着免疫荧光分析来研究类器官中细胞标志物的表达，今天为大家「偷」来了师兄的实验操作大礼包，详述了完整构建、保存类器官，并免疫染色的方法。（做细胞培养的小伙伴们可以转发收藏，避免用时迷路～）
类器官构建：圆顶包埋法
点击上方标题展开查看
为了优化培养容器的空间并简化类器官的培养操作，我们建议在 6 孔板中以 Cultrex® BME 圆顶（dome）包埋的形式培养类器官。如有需要，可扩展至更大面积的培养板。
每个圆顶中含有 50 μL 重悬于 BME 中的类器官。如图 1 所示，在 6 孔板的每孔中放置 6 个圆顶状液滴。操作完成后，将培养板置于组织培养箱中，在 37℃ 下聚合 BME。在 BME 聚合后，向每孔中加入 3 mL 类器官培养基。
图 1 在 6 孔板的每孔中放置类器官 -Cultrex BME 混合物，形成圆顶结构。1）将 Cultrex BME 和类器官置于冰上，另外同时将培养容器预热至 37℃，以便快速诱导 BME 的聚合，这可以防止类器官附着在孔的底部。2）在收集后，将类器官沉淀重悬在 Cultrex BME 中，并通过移液在每孔中（黄色圆圈）分别滴加 50 μL 的类器官-BME 圆顶状液滴。3）6 孔板的每孔中可放置 6～8 个圆顶状液滴；4）6 孔板的每孔中形成圆顶结构。
01
类器官收集和传代
点击上方标题展开查看
1. 利用 Cultrex® 类器官收获液（R&D Systems®，货号 3700-100-01）来收集类器官进行传代和扩增。
2. 弃去培养基或分化培养基，用 5 mL 冷的（2～8℃）PBS 洗涤各孔，然后与 5 mL 冷的（2～8℃）Cultrex® 类器官收获液共同孵育 30～60 分钟。
注：在此期间，将平板放置在有冰的容器内或冷库内，并轻轻振摇，让基质胶消融。
3. 在基质胶消融并释放类器官之后，将溶液转移至锥形离心管内，通过连接在注射器上的 20 号针头对类器官进行机械处理。
4. 在 2～8℃ 下以 500×g 对类器官离心 5 分钟。弃上清。
5. 用 5～10 mL 冷的（2～8℃）1XPBS 清洗类器官沉淀，并再次离心，弃上清。
6. 最后一次离心后，弃去 PBS，将类器官重悬在 Cultrex® BME 中，重新铺板。
01
固定、OCT 包埋和冷冻切片
点击上方标题展开查看
1. 弃去类器官培养基，在室温下用 5 mL 1XPBS 清洗 6 孔板的每个孔。
2. 在室温下，用 5 mL 2% 多聚甲醛（PFA）+ 0.1% 戊二醛（GA）（由 1XPBS 制备）来固定 Cultrex® BME 中的结构，时间为 30 分钟。
注：PFA 有时会导致 Cultrex BME 的解聚。戊二醛的添加解决了这个问题，不过，戊二醛的自发荧光可能较高，因此每个方案中的淬灭步骤都必须优化。
3. 用 5 mL 1XPBS 清洗 3 次，每次 10 分钟，以去除固定液。
4. 用勺子或刮刀小心地刮下类器官-BME 圆顶结构，将其置于含有 20% 蔗糖溶液（由 1XPBS 制备）的 50 mL 锥形管中，并在 2～8℃ 下放置过夜，或直至圆顶结构沉入管底（最多需要 3 天）。
5. 从蔗糖溶液中取出圆顶结构，将其置于含有最佳切削温度（OCT）化合物的包埋模具中。尽可能去除蔗糖溶液。每个包埋模具中放置几个圆顶结构。我们建议每块至少包埋 6 个类器官-BME 圆顶结构。
6. 快速冷冻，并保存在 -70℃ 以下。使用冷冻切片机，将类器官进行冷冻切片。关于类器官冷冻切片的厚度，我们建议为 10 μm。
图 2 对 BME 圆顶结构中的类器官进行固定和包埋。用 PFA和 GA 溶液固定类器官圆顶结构，并浸没在 20% 蔗糖溶液中进行冷冻保护，然后用 OCT 包埋。在含有 OCT 的冷冻模具中放置几个圆顶结构后，对类器官进行快速冷冻，并保存在 -70℃ 以下，直到进行冷冻切片。
01
免疫染色
点击上方标题展开查看
1. 用 1XPBS 清洗玻片 15 秒，以去除 OCT。
可选：使用疏水记号笔圈出类器官周围的区域。
2. 在室温下将玻片放入 10mM NaBH4 溶液（由1XPBS 制备）中孵育两次，每次 5 分钟，淬灭固定步骤后产生的醛基。如果检测到自发荧光，可延长淬灭时间。
注：淬灭样品时也可以使用 0.2 M 甘氨酸溶液（由 1XPBS 制备）来孵育两次，每次孵育 15 分钟。
3. 用 1XPBS 清洗 3 次，每次 10 分钟。
4. 在室温下用 0.15% Triton+1XPBS 处理 15 分钟，对组织进行透化处理。
5. 用 1XPBS 清洗 3 次，每次 10 分钟。
6. 在室温下用 3% BSA + 1XPBS（封闭液）或10% FBS + 1XPBS处理 1～2 小时，封闭玻片。
7. 用封闭液将一抗稀释至所需的终浓度。轻弹玻片一侧，去除封闭液，无需清洗。在类器官上加入 200～400 μL 一抗。让一抗扩散至整张玻片。
8. 将玻片放入加湿盒内，在 2～8℃ 下孵育过夜。
9. 用 1XPBS 清洗 2 次，每次 15 秒。
10. 用 1XPBS 清洗 3 次，每次 10 分钟。
11. 用封闭液将二抗稀释至所需的终浓度。在类器官上加入 200～400 μL 二抗。
12. 将玻片放入加湿盒内，在室温下孵育 1.5～2 小时。
13. 用 1XPBS 清洗 3 次，每次 10 分钟。
14. 如需复染，可用 DAPI（Tocris，货号5748）或 Hoechst 33342（Tocris，货号5117）的稀释液对细胞核进行染色，也可用鬼笔环肽（Phalloidin）对肌动蛋白进行染色。三种复染化合物均用 1XPBS 稀释。
15. 用 1XPBS 清洗一次，时间为 10 分钟。
16. 用蒸馏水冲洗，尽可能去除水分，用 Fluor 封片剂（R&D Systems，货号 4866-20）进行封片。
17. 等到玻片变干，然后用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜来观察样品。
01
应用实例（小鼠小肠和结肠类器官）
类器官的内腔结构保留
小鼠小肠和结肠类器官都形成了一个中空的内腔，在固定和冷冻切片步骤后保留这些结构的完整性可能颇具挑战。如图 3 和图 4 所示，按照上面的方案操作后，类器官的结构得以保留。
图 3 小鼠小肠类器官的分化。A）小鼠小肠类器官通常生长为球状的中空结构。B）一旦分化，隐窝和绒毛结构开始形成。E-Cadherin 的免疫荧光分析（绿色）显示了紧密连接处的染色。细胞核用 DAPI 进行染色（蓝色）。比例尺：50 μm。
图 4 小鼠结肠类器官。小鼠结肠类器官经过 5 天的培养并用 E-Cadherin 荧光抗体进行免疫染色（红色）后的代表性图像。比例尺：50 μm。细胞核用 DAPI 进行染色（蓝色）。
肠道标志物的表达
采用这种方案还可以分析各种标志物。图 5 中的 Ki-67 阳性细胞显示了小鼠小肠类器官的隐窝样结构内的增殖细胞。图 6 则显示了小鼠结肠类器官如何产生和分泌 Mucin 2（MUC2），这是一种由肠上皮的杯状细胞分泌产生的粘液形成糖蛋白。
图 5 对小鼠小肠类器官的隐窝样芽结构中的增殖细胞进行观察。Ki-67 显示了类似于小肠隐窝的出芽结构（白色虚线）中的增殖细胞（绿色，黄色箭头）。DAPI 作为细胞核复染剂（蓝色）。比例尺：100 μm。
图 6 小鼠结肠类器官中肠道分化标志物的表达。A）小鼠结肠类器官表达肠道分化标志物 Mucin 2，这是杯状细胞的标志物（红色）。B）图像与A相同，但只显示了红色通道。C）黄色箭头显示了表达 Mucin 2 的杯状细胞。DAPI 作为细胞核复染剂（蓝色）。
关于 Bio-Techne
Bio-Techne 是生物公司中率先登陆纳斯达克（Nasdaq）的拓荒者之一，2007 年，在上海成立中国分公司，助力中国生命科学事业的发展与腾飞，目前旗下已拥有 R&D Systems®、Novus Biologicals®、Tocris®、ProteinSimple®、PrimeGene® 和 Advanced Cell Diagnostics 等众多一线品牌。
Bio-Techne 可提供类器官培养方案中的四大经典细胞因子：WNER（分别代表：Wnt-3a、Noggin、EGF 和 R-Spondin 1）；小分子化合物：Y-27632、SB 202190、A83-01；培养基添加剂：N2 MAX Media Supplement；BME（BME001）等工具，让您的类器官研究更便捷、高效。
如需类器官实验相关产品，可点击「阅读原文」，联系当地经销商咨询!
内容策划：邹礼平
内容审核：陆雯芸
题图来源：图虫创意
参考文献
[1]、Barker, N. (2014) Nat. Rev. Mol.Cell Biol.15:19.
[2]、McCracken, K. W. et al.(2014) Nature 516:400.
[3]、VanDussen, K. L. et al.(2015) Gut 64:911.
[4]、Wang, X. et al. (2015) Nature 522:173.
[5]、Yin, X. et al.(2014) Nat. Methods 11:106.