最近师姐造模的小鼠开始采样了,时间紧任务重,实验室上下都来帮师姐提核酸,场面十分隆重,但最后测了一下核酸浓度,根本不够做实验的......

师兄
核酸肯定降解了!提了 3 个多小时冰都化了,核酸温度没有保障;另外操作的人太多也会导致的外源性 RNA 酶较多。

师兄
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做核酸提取实验的时候,长时间不正确的操作和保存方法确实会导致核酸降解,也就是 DNA/RNA 分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键,或者磷酸二酯键发生水解,导致 DNA/RNA 链发生断裂。浓度低的 DNA/RNA 会影响实验结果,甚至无法完成设计的实验。
因此,师兄还总结了降解常见问题和解决方案,跟着本文排查优化,就能提升核酸得率,减少降解啦!
01 实验问题:提取核酸出现降解怎么办?
● 提取的样品量要符合试剂的配比,尽量控制样品量达到合适比例;
● 每个步骤都要注意充分的混合均匀,避免团块的残留影响实验结果;
● 在洗脱时,时间过长或者温度过高,核酸有可能会降解;
● 去除环境中 RNase 酶的污染或强有力地抑制其活性;
● 可用 EDTA 等金属离子整合剂整合 Mg2+ 以抑制 Dnase 的活性
● 提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞,以防 RNA 降解
● 样本切记不可反复冻融,提取的样本要注意在合适的温度保存,长期保存尽量 -80 ℃。
02 实验问题:纯度不够高,抑制物残留影响下游实验,如何处理?
● 样本量和裂解液等试剂的配比要尽量控制在合适的范围;
● 混合均匀以确保裂解充分和没有团块残留;
● 晾干的步骤要充分,否则可能会导致醇类等杂质的残留;
● 磁棒振荡幅度太小或混合时间太短,磁珠上有杂质残留会影响磁珠吸附核酸的能力。
03 实验问题:提取的核酸得率低怎么办?
● 样品量与试剂的配比要控制在一定范围,避免超过裂解能力;
● 破碎研磨的步骤处理细节很重要,一定要充分研磨,这是核酸提取的首要条件;
● 在洗脱的步骤,使用足量的洗脱液洗脱并充分混匀,避免有团块残存;
● 实验耗材要匹配,如不同的吸附柱或磁珠的核酸吸附能力不同,也会影响核酸的得率。
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不同样本提取实验例






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内容策划:邹礼平
内容审核:吴军
题图来源:图虫创意
文中图文来自:湾区生物

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