这周组会，导师让大家 show 一下各自的细胞凋亡检测图，结果.......
大家先别吵，荧光星星点点、信号弱，大概率都是步骤出问题了，跟着师姐的思路，优化一下 TUNEL 凋亡检测实验步骤吧！
TUNEL 适用于细胞爬片、涂片以及各种切片，样本兼容范围广泛，不过周期相对较长，影响因素较多，我们通过优化核心操作步骤：固定、通透、标记这 3 步，就能拿到 CNS 都难拒绝的漂亮实验结果（文末含惊喜彩蛋～）。
3 步搞定细胞凋亡实验！
Step-1 荧光星星点点？多半是固定液有问题
原因分析：不恰当的固定会让细胞、组织自溶和变性，未经固定的细胞、组织，DNA 链会被内源性核酸酶切断，还会遇水变性，细胞发生自溶，拍出的荧光星星点点，遍布整个组织。
如何解决：乙醇、甲醇、酸性固定液，会导致标记效率降低，因此更推荐选择 4% 多聚甲醛作为固定液。但是要注意保质期哦，使用过期的多聚甲醛不仅不会帮忙，反而会加剧细胞自溶。
Step-2 荧光信号微弱？通透「打孔」很重要
原因分析：通透在 TUNEL 检测中不容小视。通透的目的是给细胞膜打孔，让标记物、酶、核酸染料能够顺利进入细胞，这个孔打得如何，直接影响后面的标记孵育效果。上面这个结果很有可能是通透出了问题，导致荧光信号弱或者看不见荧光。
如何解决：通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险，过短则有可能造成通透处理不充分，影响标记效率，为得到更好的结果，需要优化孵育时间。因此我们结合样本本身以及环境进行优化：
● 石蜡/冰冻切片推荐用试剂盒中提供的蛋白酶 K，室温通透 20 min；
● 细胞样品可用 0.2% Triton X-100 溶液通透 5 min；
● 冬季气温较低，建议提高温度至 37℃，或者延长孵育时间。
Step-3 标记要记牢
标记出了错，那就只能 say bye 喽。看看说明书似乎标记这一步十分简单，配制体系、加体系、孵育，但稍有不慎，就有可能团灭
！
明确对照是什么：一批实验，设置一个阳性对照就可以，目的是判定操作和试剂是否存在问题。不同样本，还需要做一个阴性对照（不加 TdT 酶），用来判定该样本是否存在非特异性染色，这样结果才能更有说服力。
勿干片勿过湿：片子干了不仅会出现非特异性染色，还会破坏组织，导致细胞形态无法分辨。除了干片，片子上的水分也不能太多，不然会稀释标记体系直接影响孵育效果。
摸索标记的时间：正常标记时间是 1 个小时，如果正常时间内没有标记成功，可以适当延长，具体情况具体分析。
根据以上三步进行优化，相信你也能拿到荧光又亮又清晰的梦中情图！
镜下千片过：
荧光亮、准、强
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内容策划：王丹琦
内容审核：吴军
题图来源：诺唯赞
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