2023 年 1 月 17 日，美国哥伦比亚大学欧文医学中心的研究人员在 Nature Cell Biology 期刊上发表论文[1]，研究者通过流式细胞术观察到小鼠模型出现年龄相关的血管硬度和骨髓缺氧变化导致的内皮完整性下降，证明了随着年龄的增长，衰老的骨髓微环境会不断恶化。同时研究者还发现衰老会释放白细胞介素-1β（IL-1β），这种炎症因子会驱动炎症产生并最终导致造血干细胞功能障碍，因此该靶点在改善老年人血液生成方面也具有巨大的应用前景。
随着免疫学的研究越来越深入，强大的多色流式细胞术应用也越来越广泛，熟练运用流式已经是做免疫研究的入门技能。流式细胞术虽然操作看起来简单，但如果没有注意其中的坑，就很容易出现各种问题，今天带大家探讨一下实验过程中的一些细节：
一、上机前处理
1
确定好染色方案
根据流式细胞仪配置（激光器和检测器）要求选择合适的荧光素；
根据抗原表达强弱选择亮度不同的荧光素；
多色流式时选择发射光谱重叠小的染料。
2
确定好染色顺序
相同细胞会因为染色顺序不同而影响荧光强度的差异，需通过实验来判断影响的大小；
注意有些染料会发生荧光淬灭，需控制好孵育时间。
3
准备好对照
流式对照需要齐全：未染色对照（空白对照）、单染对照、同型对照、荧光减一（FMO）对照、生物学对照、死活对照。
4
确定好每个样本细胞数
每毫升细胞数过少会导致低事件率；
细胞数过多会导致细胞聚集或者高事件率；
将细胞数控制在 1 × 106 个细胞/mL，并确定上机前再次混匀。
二、上机设定
1
调节电压
根据空白细胞对照管对细胞群进行电压调节，使细胞群控制在第一个数量级内的水平。
2
调节阈值
大多数样本都可以根据 FSC/SSC 设阈值；
阈值以下的信号不进行存储。
三、数据处理
1
选择流式数据分析的工具
机载软件、脱机软件（eg.Flowjo、LongCyte ModelFlower 分析软件）。
2
选择圈门的类型
线性门（在单参数峰图上应用）；
矩形门/十字门/椭圆门/不规则多边形门等（在双参数图上应用）。
3
确定好圈门思路
可对所有检测指标绘制上下级的树状关系草图，辅助处理。
但在流式实验过程中经常可能因为如下问题心态瞬间破防：
➣ 设计好了配色方案但仪器配置不够
➣ 样品多，手动上样时间过长，细胞状态欠佳
➣ 样品未混匀，导致上样针堵塞
➣ 上机后发现不能准确调节补偿
……
（上下滑动查看）
不难看出，想要避免这些问题的发生，除了需要实验前精确的设计和实验时谨慎的操作，流式染料与流式细胞仪的选择也很重要。
层浪生物秉承创建多彩世界，守护美丽生命的使命，致力研发生产更高端、更先进的生命科学仪器。层浪生物三光 14 色流式细胞仪 LongCyteTM 获得北京食品药品监督管理局批准的二类医疗器械注册证，（京械注准 20222220495）。22 年 5 月已在欧洲医疗器械数据系统（EUDAMED）完成注册，获准进入欧盟市场。
LongCyte™ 功能及特性
1. 26 种型号配置可选，低配可原位升级至高配
LongCyteTM 具有 26 种型号，系统配置灵活，光学系统、检测器单元和电子系统可更换：激光器配置 1～3 个，包括 488 nm 激光器、638 nm 激光器和 405 nm 激光器 ；仪器预留激光器及检测器位置，可实现低配原机升级至高配三激光或者配置更换。LongCyteTM 最高配置 3 激光 14 色流式细胞仪可同时检测 14 个荧光参数（488 nm 5 色、638 nm 3 色，405 nm 6 色）。
2. 标配自动进样系统
（1）标配内置孔板式进样盘，节省空间；
（2）兼容多种进样器：96 孔板（U 底、V 底、平底），40 孔试管架、40 孔 EP 管；
（3）自动进样、手动进样随意切换。
3. 专利设计的搅拌功能
（1）单管搅拌混匀：可设置搅拌力度和时间，保证样本充分混匀且单次处理；
（2）样本间自动清洗内外壁：极低的携带污染率；
（3）智能识别试管底部：保证珍贵样本彻底吸干，不剩一滴残留；
（4）自动报警与处理故障问题：防撞针系统和排堵功能。
4. 体积法绝对计数
（1）采用高精密度的定量泵进样；
（2）经过校准的测量系统，保证结果准确；
（3）兼容 Trucount 法测量，自动出结果。
5. 不断升级的智能分析软件- ModelFlower
（1）中英文界面切换，Windows 操作模式，简洁直观；
（2）强大的模板功能，可以保存、复制、批量应用模板；
（3）快速补偿及自动补偿功能；
（4）测量时可同时分析已测数据；
（5）可进行 40 孔流式管/EP 管或 96 孔板批量化测量；
（6）自动质控监测仪器状态，记录红蓝光延迟及仪器分辨率等性能参数状态，形成 Levey - Jennings 质控图，全程监测仪器状态；
（7）完善的数据导出功能，可以随心所欲设置导出格式，方便统计测量结果或进行 LIS 连接上传；
（8）完善的 Lis 联网功能，经过多家重点医院的使用测评，满足大部分用户的需求，解决数据整理和上传的痛点；
（9）检测报告直接输出；
（10）兼容市面上所有的细胞因子数据格式，方便导出数据。
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内容策划：邹礼平
内容审核：朱超敏
题图来源：自己做的
参考文献：
[1]. Mitchell, Carl A et al. Nature cell biology vol. 25,1 (2023): 30-41.
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