荧光定量 PCR 技术在基因表达分析、突变分析和病原体检测中不可或缺，已经成了实验室必备技能之一，然而在实际操作中，拿着师兄给的 protocol，却做不出同样完美的曲线和数据。
以下的尴尬局面，你中招了几个？
点击查看
出现非特异曲线：
可能是引物二聚体和/或错配导致的非特异性扩增
点击查看
熔解曲线底部出现小的波浪线：
可能是仪器长时间未校准造成测值不准确，也可能耗材不匹配
点击查看
QPCR 扩增曲线不光滑：
可能是模板量过高或者 RNA 纯度低
最最重要的是，师兄可以把一堆杂乱的数据变成一目了然的热图……
除了师兄的 protocol，我也好想拥有他的同款数据处理能力啊！
为了帮助大家更深入的掌握 qPCR， 丁香园携手 Bio-Rad 举办第三期《「伯」采众长，解码基因》的线上课程，将于 2023 年 1 月 11号（周三）14:00～15:00 正式开播，届时 Bio-Rad 资深应用专家何杨将带来「一键轻松搞定 qPCR 数据分析」的在线课程，轻松搞定 qPCR。
现识别下方二维码，立即参与直播，更有惊喜好礼等您拿！
参与此次直播，可以从实际案例分析中学习了解到：
1
qPCR 实验过程中常见问题的解决办法
2
如何对原始数据进行指控
3
如何快速计算基因表达分析
4
如何快速进行统计学检验分析
在课程开始前，让我们先简单了解一下 qPCR 原始数据质控关键步骤。
第一步：确保 qPCR 反应的特异
A. 核酸嵌入式荧光染料：通过熔解曲线分析（melt curve analysis）检验扩增产物的特异性
B. 水解/杂交探针法：通过检测纯合子对照反应的特异性检验
第二步：确保检测数据的精密度
➣ 通常三个技术重复是最低要求
➣ 更多的技术重复能提高数据的 Precision
➣ 理论上，当内参和目标基因 Cq 测定值的 SD 为 0.16，那么 4 个重复可在 95% 置信度水平区分 2 倍基因表达差异
第三步：检查阴性对照（negative control）和 NTC（no template control）的扩增情况
第四步：评测每个 assay 的 PCR 扩增效率，包括所有的靶标基因和参考基因的扩增效率
➣ 通过梯度稀释高浓度模板绘制标准曲线
➣ 标准曲线的斜率 Slope（S）与 PCR 扩展效率相关：Efficiency = 10^(-1/S) – 1
➣ 理想的扩增效率（覆盖至少 5 个数量级的动态范围）：90～110 %，R2 > 0.98
当涉及到文章发表时，对数据进行科学分析并处理作图时需要格外注意以下几点：
1、选择合适的内参基因，因为内参基因的表达水平在不同类型的样本中是保持不变的恒量或者差异很小。
2、当样品数量过多时不可避免会碰到多板数据合并的情况，要引入内部校正因子来尽量消除批次效应带来的误差。
3、误差传递：目前很多实验室习惯于使用 Excel 中预先编制的公式来进行以上的数据分析，这个过程涉及大量数据的复制粘贴操作，并且 Excel 会对引入的数据流格式进行自动处理以匹配公式要求，这些操作都可能会引入误差，因此要格外小心。
4、统计学分析：快速了解两种处理组之间是否存在显著性差异。
5、导出高清图表：高度定制化且可用于生成演示和发表学术文章的高清图表。
想要了解更多细节和案例分析，赶快报名我们的直播吧～
作为 qPCR 技术的主要制造商之一的 Bio-Rad 公司关注 qPCR 技术的整体解决方案和用户的使用体验，推出了集 qPCR 数据收集处理、统计学分析和数据可视化于一体的 CFX Maestro 软件，功能强大又容易上手，可以一键式对数据进行统计学分析并导出符合文献发表的高质量图表。
CFX Maestro 一个软件即可完成所有 qPCR 数据分析流程，相比过去 qPCR 软件获得实验数据后，还需导出至 Excel 等软件中进行计算、统计学分析，再借助 Graph Pad 软件作图的方式，大大简化了流程，提高了效率，降低出错率。实现了一站式的解决方案，轻松完成实验后期数据分析工作。
CFX Maestro 软件，化繁为简，助您发现 qPCR 结果之美！
* BIO-RAD 是「BIO-RAD LABORATORIES，INC.」在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。
内容策划：邹礼平
内容审核：钟可可
题图来源：图虫创意
参考资料;
[1]. bulletin 11-348 荧光定量PCR应用指南