常有小伙伴抱怨，贴壁细胞太难培养了，可真让人头秃。
莫慌，丁香实验已经替你总结好培养贴壁细胞的秘笈，请速速查收！也可以提前收藏「细胞培养大全」专题，平时心中有数，做实验不慌。
一键订阅，每周更新👇👇👇
一、贴壁细胞的分类及形态
贴壁细胞一般分为皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型。
在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其它形态，而且晃动培养液时，细胞不动。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。
二、实验材料与仪器
实验材料：细胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培养基、100X 双抗（链霉素-青霉素）、胎牛血清、细胞冻存液。
实验仪器及耗材：培养皿或培养瓶、移液枪、离心管、记号笔、封口膜、冻存管、程序降温冻存盒、液氮罐、离心机、37℃ 恒温培养箱（5% 二氧化碳浓度）、倒置相差显微镜、冰箱、无菌细胞操作台。
三、实验步骤
1. 试剂准备
DMEM完全培养基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 双抗，摇匀，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒温水浴锅中预热 15 分钟。
PBS、完全培养基、根据细胞特性选择合适的解离液或机械吹打消化细胞、胰蛋白酶解离剂 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA于 4℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒温水浴中锅预热 15 分钟。
2. 细胞复苏
1) 超净工作台使用前紫外线照射 30 分钟。使用前，后用 75% 酒精擦拭台面。保持台面干净整洁。使用时一定打开通风。
2) 将冻存细胞从 -80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2 分钟内）37 ℃ 恒温水浴中预热水浴锅中（或在手心中反复摩擦），不停晃动以化冻。
3) 立刻将化冻的细胞液转移进装有 3 mL DMEM完全培养基的 5 mL离心管中并吸打均匀。注意液体不要留在瓶口或瓶盖上，避免增加污染的可能。
4) 复苏细胞时，离心机提前降温至 4℃，以 1000 rpm 的转速将细胞悬液离心 5 分钟并弃上清。
5) 用 3 mL DMEM 完全培养基重悬细胞，并转移进 6 cm 细胞培养皿中，放入细胞培养箱中。
6) 在显微镜下观察复苏细胞的状态，并及时更换DMEM完全培养基。
7) 当细胞密度占显微镜视野 80%～90% 时，应进行细胞传代。
3. 贴壁细胞传代（以 6 cm 细胞培养皿为例）
1) 弃置原培养皿中的培养基，从培养皿边缘加入 2 mL 预热的 PBS 平衡盐溶液润洗细胞（注意不要直接冲到细胞表面）。
2) 沿培养基侧壁加入1 mL 预热的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆盖细胞表面。于细胞培养箱中孵育，孵育时间根据细胞的特点而定。
3) 向培养皿中加入1 mL 完全培养基中和 Trypsin 的作用，并轻轻吸打细胞表层数次。将细胞悬液转移到 5 mL 离心管中，在室温下以 1000 rpm 的转速将细胞悬液离心 3 分钟。
4) 小心弃去离心管中的上清液，使用 1mL 完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，使其完全被吹打为单个细胞状态，尽量减少泡沫的产生。
5) 进行细胞计数后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例进行细胞传代。
6) 取三只新 6 cm 细胞培养皿，每只培养皿中加入 3 mL 完全培养基，将细胞悬液平均分配至三只培养皿中，盖上盖子后，按照画十字的操作，将细胞摇匀。
7) 细胞培养皿放入细胞培养箱中，继续培养，每天观察细胞状态并及时更换培养液。
每个做细胞实验的人都有一部血泪史，细胞实验易学难精，小伙伴们记得要多思考多总结哦！
丁香实验推出「细胞培养大全」专题，帮大家解决实验中常见问题，丁香实验助力科研，让你的科研生涯不孤单！更多细胞培养相关内容：
点击下图
即可前往「细胞培养大全」专题订阅查看
👇👇👇
每日一答 蛋白质专场新赛季开启啦！活动期间每天更新一道基础科研题目，完成作答即可获得丁当奖励，连续答对还有机会获得精美礼品。
只要答对 14 题，2023 新年台历包邮送到家！
点击下方小程序卡片，快快 get 你的专属奖励吧～
策划制作
策划：静静菌
配图：丁香实验设计团队