师兄
师弟，你那个转化实验做得怎么样了？挑好菌直接先送测吧。
别说送测了，我现在连个阳性的影子都没看到。
师弟
师兄
你感受态细胞用的哪个？你这次转的质粒有点大，普通的感受态细胞可能不太容易成功。
做了三次了，最后一次我培养了 18 个小时都没长阳性，感受态用的是 DH5α，再这样下去我的课题很有可能就做不下去了……
师弟
师兄
你换成 DH10B 试试看，这个感受态细胞能更好的转入大质粒。感受态细胞其实有非常多种，做转化时，记得要考虑多种因素哦~
感受态细胞是分子克隆实验的重要工具，但在其使用时，一定结合转化方式、转化效率、转化通量、感受态细胞的遗传背景等进行选择，更好的匹配自己的研究目标。我们在这里为大家梳理了选择的注意点，帮助大家提升转化的成功率：
重点关注一：转化方式
转化方式分为热激和电转两种：
其中热激（化学转化）不需要配套设备，一般实验室均可进行，转化效率能满足日常克隆或亚克隆需求。由于化学感受态细胞是通过阳离子和热激处理使其细胞膜穿透性增强，所以对于某些具有细胞壁的菌株，化学转化则不太适合。
电转的转化效率更高。因此电转可用于不同浓度（从低浓度到饱和浓度）、不同大小、不同复杂度 DNA 的转化。那些不能制成化学感受态的菌株可以制成电转感受态。但进行电转需要额外的设备，如电转仪和电转杯。此外，针对不同的菌株，可能还需要对电转方案进行优化。
表 1 热激与电转的比较
重点关注二：转化效率
转化效率可反映出感受态细胞摄取超螺旋质粒的数量，因此转化效率会影响到克隆效率。感受态细胞具有不同的转化效率，受制备方法、所转化 DNA 类型、存储条件等多种因素的影响。
对于大部分分子克隆实验，10⁶ 至10¹⁰ CFU/µg 的转化效率已经足够。对于超螺旋质粒的常规克隆或亚克隆，大约 10⁶ CFU/µg 级别的转化效率即可满足。对于复杂 DNA，如平末端连接产物、短插入片段或微量 DNA，需要具有更高转化效率（～10⁸ — 10⁹ CFU/µg）的感受态细胞。电转感受态细胞（转化效率 > 1 × 10¹⁰ CFU/µg）则推荐用于最具挑战的细菌转化，如 gDNA 或 cDNA 文库构建、> 30 kb 质粒的转化等。
重点关注三：转化通量
电转由于需要电转仪和电击杯，且设置自动化流程比较困难，所以不太适用于进行高通量分子克隆。
相比之下，使用化学感受态细胞通过热激进行转化可以灵活用于不同的实验通量。对于低、中、高的细菌转化，可以选择对应包装完成实验。
以最常用的 TOP10 感受态细胞为例，Invitrogen 可提供单管式的 One Shot™ TOP10（货号 C404003）、联管式的 MultiShot™ StripWell TOP10（货号 C409601）、灵活分段式的 MultiShot™ FlexPlate TOP10（货号 C4081201）以及 96 孔板式的 MultiShot™ TOP10（货号 C40005），分别适用于不同的转化通量。
图 1 Invitrogen 感受态细胞的多种包装形式
重点关注四：细菌基因型
一个细菌菌株定义为一个细菌种类下面的一个子类，相比亲本野生型具有某些特定的遗传变异。常用于细菌转化的大肠杆菌菌株包括 DH5α、BL21、HB101 和 JM109。每个菌株可通过基因型进行描述，基因型中列出了诸如插入或缺失突变（图 2）。菌株的基因型在决定其是否适用于特定克隆实验中具有关键作用。
基因的功能和表型可通过基因型中的三个字母符号来表示。相关的基因可通过三个字母基因名称后面的大写字母进行区别，如 lacY 和 lacZ 是 lac 操纵子的两个不同基因。表型也可通过基因型中以大写字母开头且不是斜体的几个字母进行鉴定，如图 2 中 TetR代表 INV110 菌株的四环素抗性。
图 2 INV110 菌株的基因型
下表列出了感受态细胞基因型中常见的遗传标记及其作用，以及它们在细菌转化中带来的好处。当选择感受态细胞时，需要评估这些遗传标记，以确保和实验目标保持一致。
表 2 细菌转化中常用的大肠杆菌菌株遗传标记
重点关注五：研究目标
对于特殊的 DNA 类型，进行成功转化往往需要不同的转化方法、转化效率以及细菌基因型，因此选择适合的感受态细胞至关重要。
01
大质粒的克隆
选择具有更高转化效率（> 1 × 10⁹ CFU/μg）的感受态细胞进行 10～30 kb 质粒的转化；选择电转而非热激，以获得更高的转化效率；对于 > 30 kb 的 DNA 构建体（如 cosmids），选择经专门测试过的感受态细胞转化。
产品推荐
Invitrogen™ ElectroMAX™ DH10B 电转感受态细胞（货号 18290015）转化效率高达 > 1 x 10¹⁰ CFU/µg，适用于 cDNA 或 gDNA 文库构建。Invitrogen™ MegaX DH10B T1R Electrocomp™ 电转感受态细胞（货号 C640003）则具有 3 x 10¹⁰ CFU/µg 的最高转化效率，适用于文库构建或稀有珍贵质粒 DNA 的转化。
02
不稳定质粒的克隆
某些 DNA 构建体易发生 DNA 重组，因此在转化后的细菌细胞中不稳定。此类质粒构建体包括逆转录病毒和慢病毒载体，它们包含长末端重复序列（LTR）、反向重复序列和串联重复序列。
产品推荐
● Invitrogen™ One Shot™ Stbl3™ 化学感受态细胞（货号 C737303）即适用于克隆慢病毒表达载体里的直接重复序列，如用于 CRISPR 中 sgRNA 的制备。
● Invitrogen™ MAX Efficiency™ Stbl2™ 感受态细胞（货号 10268019）可稳定克隆直接重复序列、逆转录病毒序列以及串联阵列基因，转化效率高达 1 × 10⁹ CFU/µg。
● Invitrogen™ ElectroMAX™ Stbl4™ 感受态细胞（货号 11635018）则为电转感受态，适合用于构建 cDNA 或 gDNA 文库以及克隆不稳定序列。
03
DNA 甲基化
一些限制性内切酶已知对甲基化敏感，不能切割甲基化的 DNA 序列。dam 和 dcm 基因分别编码大肠杆菌中最常见的两种甲基化酶，即 DNA 腺嘌呤甲基化酶和 DNA 胞嘧啶甲基化酶。保持 DNA 未甲基化的常规做法是使用 dam 和 dcm 缺陷的感受态细胞进行转化。
产品推荐：
Invitrogen™ One Shot™ INV110 化学感受态细胞（货号 C717103）制备的质粒 DNA，下游可使用甲基化敏感的内切酶进行酶切分析。
04
含 ccdB 致死基因载体的增殖
阳性筛选法是进行菌落筛选的方法之一。在此方法中，载体在多克隆位点（MCS）中含有一个致死基因。将插入片段成功克隆到载体中，可破坏致死基因的表达并允许菌落形成。来自 F' 附加体的 ccdB 基因是用于阳性筛选的致死基因之一，并在许多克隆载体中用作筛选标记。CcdB 蛋白是一种毒素，可干扰 DNA 促旋酶的重新结合步骤，使宿主染色体片段化并抑制细胞生长。为了增殖具有活性 ccdB 基因的克隆载体，宿主细胞必须能够抵抗 CcdB 的毒性作用。
产品推荐：
产品推荐：使用Invitrogen™ One Shot™ ccdB Survival™ 2 T1R 感受态细胞（货号 A10460）用于含 ccdB致死基因载体的增殖，并可搭配 Gateway™ 系统使用。
05
重组蛋白在细菌中的表达
重组蛋白表达中最常用的大肠杆菌菌株是 BL21 及其衍生菌株，以下整理了常用菌株特点，供大家针对性选择。
产品推荐：
● Invitrogen™ One Shot™ BL21（DE3）化学感受态细胞（货号 C600003），可在 IPTG 诱导下高水平表达目的蛋白，但其外源基因的基础表达水平较高。
● Invitrogen™ One Shot™ BL21 Star™（DE3）化学感受态细胞（货号 C601003）适用于从低拷贝质粒中进行高水平蛋白表达。
● Invitrogen™ BL21 Star™（DE3）pLysS One Shot™ 化学感受态细胞（货号 C602003），适用于从高拷贝质粒中进行高水平蛋白表达。
● Invitrogen™ BL21-AI™ One Shot™ 化学感受态细胞（货号 C607003）适用于有毒蛋白质的高水平表达。
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自从商业化感受态细胞推出以来，Invitrogen 一直致力于感受态细胞技术的开发，探索菌株开发和转化效率的前沿发展。Invitrogen 可提供多种类型的化学感受态和电转感受态细胞，用于常规克隆、文库构建、蛋白表达以及一些特殊应用。此外有多种包装形式可选，可根据转化通量灵活选择。以下为 Invitrogen 感受态细胞选择指南，希望能助您选到最适合的感受态细胞。点击「阅读原文」，可免费获取高清指南、分子克隆技术手册等资料。~
图 5 Invitrogen 感受态细胞选择指南
内容策划：邹礼平
内容审核：吴军
题图来源：图虫创意
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