实验室中时常听到这样的困惑，「明明通过免疫荧光（IF）能看到目的蛋白表达在细胞核膜上的表达，但为什么不论用总蛋白还是核蛋白进行 WB 检测，都无法检测到目的蛋白？」 类似这样的问题，你是否也深有感触？
一、IF & WB
免疫荧光（IF）和免疫印迹（WB）都是利用抗原和抗体的特异性结合对目的蛋白质进行检测。IF 采用抗体和荧光检测固定细胞或组织中目的蛋白的定位、相对表达和激活状态；而 WB 则通过分析条带位置和着色条带深度来获取目的蛋白质在细胞或组织中表达情况的信息。
图 1. 免疫荧光和免疫印迹原理
（图片来源：Native autoantigens versus recombinant autoantigens，doi.org/10.1016/B978-044452763-9/50010-X）
IF 的数据评估依赖于视觉判断，其结果的解释具有主观性[1]。因此，通常情况下，IF 实验更适合对目的蛋白分布范围、空间相互关系进行评价；而 WB 实验常用于对目的蛋白进行定性和半定量分析[2]。
二、可能的原因
IF 实验是原位检测技术，而 WB 实验则需要先将靶蛋白提取出来再进行检测。IF 实验能检测到目的蛋白，而在 WB 中却没有出现目的条带，其常见的原因有两个：一是目的蛋白表达量过低，无法达到 WB 检测下限；二是在样品制备过程中，目的蛋白发生了丢失。
总的来说，就是蛋白样品出了问题！
三、如何解决
首先，我们需要了解目的蛋白的情况。
通常我们可以借助 UniProt、BIOGPS、GEPIA、The Human Protein Atlas 等工具查询目的蛋白相关信息，明确目的蛋白的表达量、定位信息等基本情况之后，做出初步原因判断，再选择相应的解决方案。
下面我们整理了 3 种解决蛋白样本问题的方法，详细的解决步骤一次说清：
3 步教你解决蛋白样品问题
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蛋白样品制备作为 WB 的起始步骤，是尤为关键的一步，实际操作中的每一个细节都不容忽视。尽可能提高蛋白样品的质量，有助于更好更快的达到我们预期的实验结果。
丁香实验推出「 WB 专题」帮大家解决实验中常见问题：
WB 转膜的条件设置
WB 如何 1 分钟蛋白定量
5 步搞定 WB 结果图的灰度扫描
如何解决 ECL WB 非特异条带与背景问题？
WB 同一批次蛋白跑出的条带为何不一致？
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策划：王琴
配图：丁香实验设计团队