作为实验室的小白，我时常羡慕师兄设计的 PCR 引物在测试之后没有一点杂峰。
时常也会惊叹，为什么他们就能做出这样完美的标准曲线，扩增效率接近 100%？
我也做到了
！一周做了快十次 qPCR，终于拿到了接近完美的单峰熔解曲线！结果组会上还是被导师看出了问题，熔解曲线虽是单峰，但不尖锐，可能会存在大小相近的非特异性产物。
qPCR 折磨了一个又一个的实验人，好的结果像海市蜃楼一样可望而不可及。为帮助大家更好上手 qPCR 实验，拿下每个细节点。2022 年 12 月 21 日（周三） 14:00～15:00 ，丁香园联合 qPCR 界老法师 Bio-Rad 将举办「伯」采众长，解码基因系列课程第二讲，本次直播邀请到 Bio-Rad 资深应用专家滕希将带来主题为【一个成功的 qPCR 实验需要关注这 2 个关键点——Assay 的优化与验证】的在线课程直播。
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一个成功的 qPCR 检测需要高的扩增效率和高特异的扩增，而 PCR 检测的效率、特异性会被引物和目标序列所影响，选择目标序列和设计引物时必须慎重。同时设计好的 assay 性能究竟如何，检测结果是否可靠可重复，也需要用实验数据来说话，所以要进行 assay 的优化与验证。Bio-Rad 将在「伯」采众长，解码基因第二期直播中，带你系统学习 qPCR 的 assay 设计、优化以及验证。
课程内容预告：
1、在反转录阶段如何选择合适的反转录引物策略和反转录试剂；
2、重点关注 qPCR 扩增阶段引物探针设计的注意事项；
3、如何通过熔解曲线、标准曲线和温度梯度功能等实验的设计来优化；
4、如何验证 assay 的特异性、灵敏度、最佳退火温度、扩增效率等；
5、如何优化多重 qPCR 实验的设计方案。
课程亮点抢先看：
知识点 1：探针设计有哪些基本原则？
1. GC 含量 40～60%，长度一般 20 bp 左右。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高，过短则导致特异性下降；
2. Tm 值一般比引物的要高 5～10℃；
3. 5’ 端不能安置 G 碱基。G 碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。
知识点 2：如何通过熔解曲线的分析非特异性扩增？
qPCR 产物大小在 75～200 bp 之间，其熔解温度约为 80～85℃。首先观察熔解曲线，在非单峰的情况下，说明有非特异性扩增出现。此时观察峰值出现位置，如果在 85℃ 以上出现波峰，可能为错配导致的非特异性扩增。如果在 80℃ 以下出现波峰，一般考虑是引物二聚体。
知识点 3：反应扩增效率过低，可能存在的原因有哪些？
1. 引物探针设计不好或扩增子具有二级结构；
2. 温控反应条件不合适；
3. 试剂、酶无活性或活性降低；
4. 移液、稀释、加样误差；
5. 标准曲线动态范围窄；
6. 样品抑制，抑制剂等。
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注：* BIO-RAD 是 「BIO-RAD LABORATORIES, INC.」 在特定区域的商标。* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。
内容策划：王丹琦
内容审核：钟可可题图及文中图片均来自伯乐