CRISPR/Cas 系统，是原核生物用于应对病毒攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制。2012年 Jennifer Doudna 与 Emmanuelle Charpentier 团队在 Science[1] 上发表了一篇具有划时代意义的论文，他们详细揭示了如何利用 CRISPR/Cas 系统在体外对 DNA 进行精确切割，通过向导 RNA 和核酸酶 Cas 蛋白在基因组上特定位点进行序列编辑，高效、精准且可设计。
CRISPR/Cas 技术可以同时靶向多个靶点，切割效率极高，设计简单的同时它的识别不受基因组甲基化的影响，因此在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表观遗传修饰及 3D 基因结构改变中都有着优越的表现。2013 年，Science 更是将 CRISPR/Cas9 技术列为年度十大科技进展之一，Jennifer 与 Charpentier 也因在基因编辑技术上付出的巨大贡献斩获了 2020 年的诺贝尔化学奖。
大自然的精巧设计总是令人意想不到，2022 年 11 月 23 日，Jennifer Doudna 再次发文[2]，表示他们在噬菌体中也发现了 CRISPR-Cas 系统！他们利用宏基因组学分析噬菌体中的 CRISPR-Cas 系统，发现不但涵盖了所有已知的六种 CRSIPR-Cas 系统类型，其中还有一些 Casλ 酶（仅 700 多个氨基酸大小）也能够编辑植物和人类细胞基因组。这一新发现扩大了人们对于新来源 CRISPR-Cas 的理解，相信噬菌体中这种兼顾小体积和高效率的基因编辑器，会给科学家们更多灵感。
开启诺奖同款研究的第一步就是合成属于你自己的单向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）。传统的sgRNA合成方式包括质粒转染、体外转录等，但它们制备成功率不稳定，并且有可能带来细胞毒性，使用上有一定的局限性。通过化学方法合成 sgRNA，可以在一定程度上避免上述问题。想要了解更多化学合成 sgRNA 的内容，现在扫码咨询，即可下载电子版服务/技术资料，前 50 名还送 2023 年定制日历。
化学合成 sgRNA 的优势
我们通过以下四个维度（尿素-TBE 胶、ESI-MS、体外酶切和细胞实验），来对化学合成 sgRNA 的化学质量和生物有效性进行分别验证。
尿素-TBE 跑胶结果
通过化学合成 sgRNA 尿素-TBE 跑胶结果（图 1），我们可以看到主条带清晰且单一。图中，最左端为可靠来源的 60 nt 的 RNA，右端四条为 99 nt 的 sgRNA。
图 1. 99 nt 的 sgRNA 采用 10% UREA-TBE 变性胶进行 QC 结果图
ESI-MS
通过 ESI-MS（图 2），我们可以看到化学合成的 sgRNA 目标分子量单一，目标分子量为 32,124.2，实测分子量为 32,125.1，二者偏差值 ≤ 0.05%，确认合成的 RNA 分子量和理论值一致。
图 2. 100 nt 的 sgRNA 采用 ESI-MS 进行 QC 结果图
体外酶切实验及效果验证
在体外酶切实验中，采用化学合成的 sgRNA 或 crRNA：tracrRNA 组合，相较于传统的体外转录的方法，拥有更好的剪切效果（图 3）。
图 3. 不同合成方式酶切实验效果验证
此外，有文献报道[3]，在 sgRNA 的 5’ 和 3’ 端各加 3 个硫代和甲氧基修饰，可以提高 sgRNA 稳定性，并降低脱靶效应。我们也通过化学方法合成了修饰后的 sgRNA，进行体外酶切实验验证（图 4）。其中，G2 和 G3 表示未修饰的 sgRNA 序列；M2 和 M3 表示 5’ 和 3’ 端各 3 个硫代和甲氧基修饰 sgRNA 序列。可以看到所合成的修饰和未修饰的 sgRNA 均具有体外酶切活性。
图 4. 化学修饰 sgRNA 的体外酶切实验效果验证
基因编辑实验效果验证
通过对 HEK293T 细胞进行 Cas9/sgRNA 的 RNP 电转实验，我们对于基因组上某个序列进行了随机突变，通过分析相应的 sanger 测序结果（图5），我们可以看到通过 Azenta PureWiz® 高精纯化方法化学合成的修饰 sgRNA 有较好的编辑效率，效率接近 100%，优于体外转录或是质粒表达制备的 sgRNA。
图 5. 不同合成方式的 sgRNA 细胞基因编辑实验效果验证
以上数据表明，通过化学方法合成 sgRNA，纯度更高，可以有效避免其他核苷酸杂片段的干扰；其编辑效率相比传统的体外转录或质粒表达等方法也更为高效；而经过化学修饰后，sgRNA 变得更加稳定，能够进一步提高基因编辑效率。
sgRNA 的细胞毒性检测
我们通过将不同制备方式得到的 sgRNA 进行 RNP 电转，对细胞进行培养，在不同时间段分析细胞数量来对比毒性（图 6）。24 h 及 48 h 通过 Azenta PureWiz® 高精纯化方法化学合成的修饰 sgRNA 对应的细胞数量最多生长速度最快，毒性最低；72 h PureWiz® 高精纯化 & IVT 制备方式的细胞数量达到峰值，质粒电转毒性相对较高。
图 6. sgRNA 的细胞毒性检测
以上数据表明，通过化学方法合成 sgRNA，细胞毒性更小，不影响细胞的正常生长。
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内容策划：王丹琦
内容审核：朱卿
题图来源：图虫创意
文中图片来源：安升达
参考文献：
[1]. Jinek, M.;Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A.; Charpentier,E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in AdaptiveBacterial Immunity. Science. 2012. 337(6096),816–821. doi:10.1126/science.1225829
[2]. Diverse virus-encoded CRISPR-Cas systems include streamlined genome editors, Cell,Volume 185, Issue 24,2022, doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.020
[3]. Hendel, A.; Bak,R. O.; Clark, J. T.; Kennedy, A. B.; Ryan, D. E.; Roy, S.; Steinfeld,I.; Lunstad, B.D.; Kaiser, R.J.; Wilkens, A. B.; Bacchetta, R.;Tsalenko, A.; Dellinger, D.; Bruhn, L.; Porteus, M. H. Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in humanprimary cells. Nature Biotechnology. 2015. 33(9),985–989. doi:10.1038/nbt.3290
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