1小时!讲清 WB 实验的全过程(内含技巧)

2022-12-01 20:03 来源:微信公众号 - ShengWuXueBa 作者:生物学霸
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常有实验小白抱怨,读了各种 WB 实验技术贴,然而很少有入门级的 WB 操作方法。


基于实验小白们的诉求,丁香实验特此整理了一份详细且易懂的 WB 实验操作方法,手把手教小伙伴们理解 WB 实验的全过程。



一、实操详解视频


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此外,丁香实验还给大家梳理了实验所需材料和步骤的文字详解版本,感兴趣的同学,接着往下看吧~



二、实验步骤详解


(一) 配胶


1. 洗玻璃板:用洗洁精洗净,再用蒸馏水冲洗后,使用无水乙醇进行润洗,放置,自动晾干(或使用吹风机吹干)


2. 配置分离胶:制备 5 ml/gel的分离胶,用合适规格的移液枪吸取 1.9 ml/gel DDW、1.7 ml/gel 30% Acr-Bis(29:1)、1.3 ml/gel 分离胶缓冲液、0.05 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED 于 EP 管,使用震动仪混匀后放置通风橱


3. 安装制胶架:
将玻璃短板和长板置于制胶架,注意将两块板下层对齐,卡紧,移至通风橱用以注胶


4. 注入分离胶:
用胶头滴管吸取分离胶,小心注入,直至分离胶上缘至长板上缘2 cm左右处,顶层注入无水乙醇,等待30 min后凝胶,倒出无水乙醇


5. 配置浓缩胶:
制备 2 ml/gel的分离胶,用合适规格移液枪吸取 1.15 ml/gel DDW、0.33 ml/gel 30% Acr-Bis(29:1)、0.5 ml/gel 浓缩胶缓冲液、0.02 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED于EP管,使用震动仪混匀后放置通风橱


6. 注入浓缩胶:用胶头滴管将浓缩胶注入预留好的 2 cm空隙,小心插入加样梳,注意不要残留气泡,等待 30 min凝胶


(二) 上样与电泳


1. 将玻璃板从制胶架拿出,放入提前洗净的电泳槽内固定,垂直拔出梳子,在内槽加入足够电泳液,冲出加样孔内的气泡,根据所需上样量,使用相应的移液枪在上样孔加入样品及 marker


2. 上样完毕后,在外侧电泳槽加入电泳液至相应刻度处(2 板或者4 板),盖上电泳槽的盖子(注意正负极)


3. 打开电源,于 80 V电压下电泳,等待样品下缘齐平后调至 120 V,等待大约 90 min 溴酚蓝跑至即将出胶的位置


(三) 转膜


1. 准备相应大小的一张 0.45 μm 或 0.22 μm PVDF膜(孔径根据目的蛋白分子量确定,低于 20 kDa 小分子可选择孔径小的膜)和四张滤纸,置于电转液中浸泡,PVDF 膜先于甲醇中活化


2. 翘开玻璃板剥胶于电转液中,洗去残留的电泳液,后小心置于电转夹上,不能有气泡,电转夹板黑色板(负极)置于下部,按照“海绵-滤纸-胶-PVDF  膜-滤纸-海绵”的顺序安装好,每一步都要避免气泡


3. 夹紧后放入电转槽中(电转槽预先放入加冰的塑料盆内),电转液加满并加冰块,295 mA 下转膜 1.5 h或 2 h(转膜时间依据目的蛋白分子量大小决定,大于 200 kDa 的蛋白可适当延长转膜时间)


(四) 洗膜


电转完成后,将 PVDF 膜放进玻璃皿,用 TBST 溶液浸泡,放于摇床上 90 r/min*5 min,重复三次,洗去残留的电转液


(五) 封闭


弃去 TBST 液,5% 脱脂牛奶浸泡 1 h,60 r/min


(六) 抗体孵育


加一抗:将 PVDF 膜用 TBST 液浸洗三次,90 r/min* 5 min,根据目的蛋白及内参蛋白的分子量确定裁膜位置,装入抗体孵育袋,并加入适宜量的一抗溶液(2~3 ml为宜),小心封好,不要挤压 PVDF 膜,放入冰箱,4°C 过夜;


加二抗:


1. 过夜后取出,将抗体孵育袋放到摇床上恢复室温30 min,60 r/min,回收一抗


2. 将 PVDF 膜取出(注意镊子夹在膜的边缘位置),用 TBST 液浸洗三次,每次5~10 min,90 r/min


3. 将PVDF膜放入暗盒,加入带有荧光的二抗溶液,放置于摇床孵育 90 min,60 r/min


4. 结束后用 TBST 液浸洗三次,每次5~10 min,90 r/min


5. TBST液浸洗一次,5~10 min,90 r/min


(七)红外扫膜仪显影


注意避光以及膜的整洁



三、更多 WB 实验相关学习内容



看过上述实验步骤,科研小白们心里是否有底了呢?面对 WB 实验,其实没有所谓的玄学,经验需要慢慢积累,好的产品则会让实验进程事半功倍


这一次,丁香实验从庞杂市场上,选择了一些质量过关,且曾经在文献中被使用过的蛋白类相关产品,为你的实验保驾护航!  

1

小鼠Leptin重组蛋白



【文献标题】Gab2 deficiency suppresses high-fat diet-induced obesity by reducing adipose tissue inflammation and increasing brown adipose function in mice【出版期刊】Cell Death & Differentiation
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2

LN521™ - 人类重组层粘连蛋白LN521



【文献标题】Dynamic blebbing: A botileneck to human embryonic stem cell culture that can be overcome by Laminin-Integrin signaling
【出版期刊】Stem Cell Research, 2018
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3

重组蛋白RANKL,Mouse,AF



【文献标题】 Mechanism of transepithelial migration of lymphocytes into the milk in porcine mammary glands.
【出版期刊】
Reprod Immunol. 2021 Oct 29 
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策划制作


策划:丁香实验团队

配图:丁香实验设计团队


编辑: 王凯

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