2022 年 6 月 21 日，清华大学药学院丁胜教授团队在国际顶尖学术期刊 Nature 发表一篇研究，引爆学术圈。该团队发现了一种全新的药物组合——TTNPB、1-Azakenpaulllone、WS6，这三种小分子药物组合（TAW），可以将小鼠多能干细胞（PSCs）诱导成具备转变为完整有机体潜能的全能干细胞（TotiSCs），而且可以在实验室中保持这些诱导的细胞的全能型[1]。
其中分析诱导细胞表观基因组学和代谢特征利用了 ATAC-seq 技术，为什么近年来 ATAC-seq 技术如此受高分文章的青睐？
染色质开放区域对于研究基因的表达调控至关重要，为了获取这些开放的染色质区域，MNase-seq、DNase-seq、FAIRE-seq 等手段也被广泛应用，但缺点明显，实验步骤繁多，重复性差，需要的细胞量大，测序信号不理想等等，而 ATAC-seq 技术完美的克服了这些困难。
ATAC-seq 究竟是什么？
ATAC-seq，全称 Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughout sequencing，即利用转座酶研究染色质可接近性的高通量测序技术，是一种创新的表观遗传学研究技术。
图片来源：近岸蛋白
我们知道染色体是由 DNA 一圈一圈地缠绕在组蛋白上，形成串珠式的结构，再进一步折叠、浓聚，并在其他架构蛋白的辅助下最终形成的。基因的转录过程中，DNA 的高级结构必然需要解开，但是不需要 DNA 链完全解开，而是只需要打开一部分，也就是表达基因的区域解开即可。
而这一过程，主要由染色体组蛋白的修饰（例如乙酰化）来实现的，这部分打开的染色质，被称作开放染色质（open chromatin）。而处于开放状态的染色质，可以和一些调控蛋白相结合。
染色质的这种特性，被称作做染色质的可及性（chromatin accessibility），所以说染色质的可及性反映的就是调控因子与开放染色质结合的状态，与转录调控密切相关。
ATAC-seq 的核心技术酶——转座酶 Tn5 可以把 DNA 序列从染色体的一个区域插入到另外一个区域，且这个过程要求插入位点的染色质处于开放状态，否则就会被各种二级和三级结构给卡住。
既然转座酶 Tn5 容易结合在开放染色质上，我们只要将 NGS 接头序列连接到转座酶上，携带这些接头的转座酶进入细胞核后，在染色质开放区域对裸露的 DNA 序列进行切割，使染色质断裂并将这些接头插入到开放的染色质区域中，这样裂解细胞、破碎 DNA 后，利用已知序列的测序标签进行 NGS 测序，就得到了染色质开放区域的 DNA 文库序列。
ATAC-seq 有哪些实验流程？
一般而言，ATAC-seq 文库构建的实验流程包括以下几个部分，其中最核心的是前两步，关系到整个实验的成败。
图片来源：近岸蛋白ATAC-seq 建库实验流程：
➣（1）裂胞
裂解细胞，制取细胞核，常用的基础细胞裂解液，适用于人源、鼠源的细胞系。对于其他细胞系的裂解，可以在此基础上添加相应的成分。
参考细胞裂解液 1，适用于部分人源、鼠源细胞系：10mM Tris-HCl (pH7.4), 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 0.1% NP40, 0.1% Tween 20, 0.01% Digitonin；
参考细胞裂解液 2，适用于胚胎等难裂解的细胞：10mM Tris-HCl (pH7.4), 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 0.5% NP40；
参考细胞裂解液 3：10mM Tris-HCl (pH7.4), 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 0.1% IGEPAL CA-630。
➣（2）片段化
打断基因组，获取目的片段。此模块需包含一个孵育测序接头的 Tn5 酶，近岸蛋白提供特殊优化的Chromatin Profile Kit for Illumina（目录号：N248），经过 ATAC-seq 实验证实，可以实现 500～50,000 个细胞建库，核小体分布清晰、信噪高、特异性强。
特殊优化的 Tn5 酶在 ATAC-seq 实验中的应用
图片来源：近岸蛋白
➣（3）DNA 提取
片段化之后，可以选择性的进行 DNA 提取。近岸蛋白提供小片段 DNA 提取磁珠（目录号：N245），该磁珠能够完整的保留 40～100 bp 的小片段。
图片来源：近岸蛋白
➣（4）扩增
PCR 将 index 连到目标片段上，完成文库构建。
➣（5）文库纯化
构建好的文库需要纯化后方可用于后续测序。
ATAC-seq 技术优势有哪些？
1
更快更精准
简化的实验过程减少了样品制备的时间，减少了误差的概率，显著提高了实验的成功率和重复性。相比而言，DNase-seq 和 MNase-seq 实验通常需要 2～3 天，FAIRE-seq 实验通常需要 3～4 天。如下图所示，相同条件下 ATAC-seq 的数据精确度要优于其他方法，且 ATAC-seq 的可重复性更好，所需时间更短，同时测序信号更好。
在相同实验条件下进行的染色质可及性分析的示意图 (Tsompana et al., 2014)
2
节省样本量
实验所需样本量极大的降低，从 100 万个细胞（FAIRE-seq）和 5,000 万个细胞（DNase-seq）减少到大约 500 个细胞。当样本数量较为有限时，这一优势尤为突出。
3
物种适应性较好
可以在不同的物种中完成 ATAC-seq 实验。如下图所示，在人源、小鼠、拟南芥和水稻等物种中均可得到较好的实验数据[2、3、4]。
不同物种应用 ATAC-seq 技术的实验结果（Guifang Du et al.,2022；Kelsey A. M et al.,2017；Shenli Yuan et al.,2022）
4
成功应用于单细胞测序
单细胞测序技术是近几年研究的热点，通过对单细胞的测序能够将表观遗传学研究个体化。常见的技术无法进行单细胞测序，而 ATAC-seq 技术已经成功应用于单细胞测序。
人类皮层单细胞的转录机制和表观遗传分析（Alexandro E T et al.,2021）
综上所述，ATAC-seq 是一种高效探索染色质开放区的技术，其以简便高效，信噪比高，重复性好等优点，已成为研究染色质开放性首选的技术方法。
除此之外，CUT&Tag 等方法也在表观遗传研究领域大有作为，是广大学者发表高分文章的得力助手！
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3. 苏州近岸蛋白科技股份有限公司保留本次活动的最终解释权，如您有任何疑问，欢迎拨打客户电话咨询：400-600-0940。
内容策划：那雪妍
内容审核：朱晓芳
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1]. Yanyan Hu et al., Induction of mouse totipotent stem cells by a defined chemical cocktail. Nature. 2022 Jun 21.
[2]. Guifang Du et al., The accessible promoter-mediated supplementary effect of host factors provides new insight into the tropism of SARS-CoV-2. Molecular Therapy - Nucleic Acids. Volume 28, 2022.
[3]. Yuan S et al., The histone modification reader ZCWPW1 promotes double-strand break repair by regulating cross-talk of histone modifications and chromatin accessibility at meiotic hotspots. Genome Biol 23, 187 (2022).
[4]. Kelsey A et al., Profiling of Accessible Chromatin Regions across Multiple Plant Species and Cell Types Reveals Common Gene Regulatory Principles and New Control Modules. The Plant Cell, Volume 30, Issue 1, January 2018, Pages 15–36.
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