新来的师弟做小鼠活体成像做了一个月都还没有结果，回回组会被老板骂。最近师弟终于撑不住了来找我帮忙。看了结果才发现，师弟根本「不会做」活体成像。
师弟
师兄，我做的活体成像效果很差，你有什么妙招吗？
自发荧光的影响很大，你先做好预实验。还有，你的小鼠成像前怎么都没脱毛呢？这个影响很大的！
师兄
师弟
谢谢师兄，这些问题我之前都没注意过，我重新试试。
其实小鼠的活体成像真的没有那么难，选择好一台靠谱的仪器，再按照我笔记中的基本操作和注意事项逐步执行即可。
师兄
师弟
可以看看师兄的仪器和笔记吗？
用 AniView 多模式动物活体成像系统吧，我之前的文章就是用这台仪器做的，现在还有活动免费试用！
师兄
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AniView 多模式动物活体成像
系统试用资格
在搞定仪器后，根据以下师兄笔记理解实验原理，并排查常见实验问题，基本可以做出好的结果。
活体成像实验
原理及优势
活体动物体内光学成像（Optical in vivo Imaging），以下简称活体成像，主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或 DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP、Cyt 及 dyes 等）进行标记。
活体成像技术可以对同一个样本进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果造成影响，又不需要杀死实验动物。此外，在转基因动物筛选实验中，可以更早期、更快速、高通量精确筛选目标动物，具有廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性，可提高实验效率。
3 个因素
影响成像效果
主要需要考虑以下影响因素：底物给药方式、荧光标记物波长和动物毛发。
1、底物给药方式
常用的底物给药方式有腹腔注射和尾静脉注射。
腹腔注射：迅速分布全身，并穿过包括大脑在内的血液组织屏障；注射底物 10～20 分钟后，发光信号达到峰值；60 分钟内逐渐减少，直到不可检测。
尾静脉注射：可提供更好的再现性和 5～10 倍的高信号，但是注射难度较高，代谢快。
建议：第一次使用荧光素酶底物成像，或者更换新品牌底物，需要进行预实验，观察底物在何时达到峰值。确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟，然后将此时间用于所有实验，以标准化成像数据。
2、荧光标记物波长
大多数生物体内都表现出一种天然的荧光，通常被称为「自发荧光」。这些荧光与标记物发射波长重叠，经激发光照射会发射出与标记物相似的荧光波长，导致低信噪比，检测灵敏度受限，甚至无法检测。譬如，GFP 的最大激发波长是 488 nm，最大发射波长是 507 nm。
这和皮肤及毛发中的胶原蛋白和弹性蛋白等成分的发射波长相近，有较高的背景信号。此外，标记物激发波长越短，散射越强，吸收越大，穿透深度越浅，越不利于体内深层部位的信号检测。
建议：使用近红外波长的荧光染料，优点是更高信噪比，穿透更深，或使用 iRFP 作为报告基因，该荧光蛋白具有更高的亮度、光稳定性和信噪比。
3、动物毛发
C57BL/6 小鼠毛发生长周期由三个阶段组成：静止期（皮肤为淡粉色）、生长期（皮肤变为深灰色或黑色）、成熟期（毛发停止生长，皮肤恢复为淡粉色）。
生长期中的皮肤色素沉着是活体成像中的一个重要变量，特别是当需要对小信号变化或动物之间的差异敏感时。强烈着色的皮肤可导致 90% 以上的光信号衰减，这显然会导致显著的实验误差。此外，就算是处于静止期或成熟期的小鼠，身上的毛发也会造成一个数量级的光信号衰减。
建议：成像前一天，需要通过剃毛或化学脱毛来去除观察区域的毛发，以便最大限度地收集信号。
若以上内容还未解决你的活体成像的问题，欢迎扫描下方二维码进行咨询。BLT 公司专业技术工程师将随时答疑、助力科研。即日起至 2022 年 12 月 31 日 AniView 多模式动物活体成像系统免费试用！
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活动说明：
1. 本次活动仅限终端用户参与，每个单位仅限申请一次。
2. AniView 多模式动物活体成像系统申请审核通过后 5～7 个工作日，由当地经销商进行沟通，协调仪器使用。
3. 本次活动最终解释权归广州博鹭腾生物科技有限公司所有。
内容审核：那雪妍
项目审核：钟可可
题图来源：图虫创意
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