在环境微生物组的研究中，我们往往需要提取土壤样本中的核酸做分析。但是土壤样本组分包含复杂的无机物、有机物及微生物。除了成分复杂外，土壤中的腐殖质还会抑制 PCR 过程，以及限制性酶切，对后续的实验造成影响。因此，从土壤中提取核酸相比于从组织、细胞中提取更加复杂。
在实验时，总会遇到以下这些情况：
● 提取的 DNA 得率低；
● 提取的核酸出现降解，跑胶有弥散现象；
● 提取 DNA 的纯度过低，残留抑制物影响下游实验。
以上问题可以算是土壤核酸提取 TOP 3 的难题。我们会逐一进行分析，帮助大家找到避免出错的方法。同时本次也为大家准备了 MP Bio 土壤试剂盒的试用活动，MP 在研究土壤样本 DNA 纯化方法的过程中，针对土壤样本核酸纯化的难题给出了针对性的解决方案，可有效提取样本 DNA，操作简便快捷，样本应用范围广，提取困难样本也不在话下。
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1、Q：DNA 产量低怎么办？
● 样本微生物含量低：① 增加样本量；② 调节样本的含水量等因素来优化裂解条件。
● 裂解不充分：增加物理破碎的时间和次数。
● 检查洗涤液中是否加入乙醇。
● 洗脱不充分：建议二次洗脱增加产量或提高洗脱体积。
2、Q：提取的 DNA 出现降解怎么办？
● 优化裂解条件，避免过度裂解，降低物理破碎的力度
● 操作过程中是否有污染 DAase，造成 DNA 降解
● 样品用量太多：杂质和腐殖酸含量过高的样品，可使得当降低样品的用量
● 样品中含有二价金属离子：可在裂解液中加入 EGTA
3、Q：提取 DNA 的纯度过低，残留抑制物影响下游实验怎么办？
● 样本复杂含有有机质高：需要特别去除杂质，必要时可以使用 PBS 清洗土壤并收集菌体；
● 杂质去除效果差，杂质残留多：选择有去除蛋白、腐质酸等复杂抑制物的去杂剂；
● 乙醇等没有充分挥发：晾晒步骤要充分，使醇挥发。
4、Q：提取的 DNA 无法扩增怎么办？
● 检测 DNA 的浓度：过量的 DNA 模板也会抑制 PCR 反应
● 样本 DNA 稀释之后可以扩增：样本中的腐殖酸等抑制物含量高。
● 确定 PCR 反应条件是否已优化：退火温度，时间，引物等等
● 非特异条带：洗脱液中目的 DNA 的丰度可能比较低。如果样品中的目的微生物含有比较厚的细胞壁，可能需要额外的破碎裂解。
5、洗脱的 DNA 颜色为黄色或棕色怎么办？
腐殖酸含量高：
● 在洗涤步骤之前，可先用 4.5 M～5.5 M 的异硫氰酸胍溶液洗涤 1～2 次。
● 减少样本用量。
6、A260/A280 比值偏低怎么办？
● 蛋白去除不干净：增加蛋白沉淀离心的次数。
● 洗涤不干净：增加洗涤次数。
7、A260/A280 比值高怎么办？
● RNA 含量高，可在洗脱之后的溶液中加入 RAase 消化。
8、A260/A230 比值低怎么办？
● A230 是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230 高表示样品中存在一些污染物。
① 蛋白去除不干净：增加蛋白沉淀离心的次数。
② 杂质去除不干净：洗脱之前，核酸吸附柱中尽可能不要残留液体，可增加空离心次数和时间。
9、Q：土壤样品含水量过高怎么办？
如果土壤样品过湿，可先将样本 10,000 x g，离心 30s，尽可能多的去除液体。
10、Q：腐殖质、有机含量高的土壤样本
腐殖质是有机物经微生物分解转化形成的胶体物质，一般呈现出比较深的颜色。黑土就是一种富含大量腐殖质的土壤。腐殖质性质与 DNA 相似，是一种大分子亲水性阴离子聚合物，很容易与核酸一起被抽提出来，腐殖酸的残留会抑制 DNA 聚合酶的活性从而影响 PCR 的过程，进而影响后续的分子生物学实验和测序结果。如果洗脱的 DNA 溶液呈现黄色，或者 A260/230 偏低，通常就是腐殖质与 DNA 一起被洗脱下来。
对于腐殖质、有机质含量高的样本，传统的方法可以在裂解前通过试用 PBS 清洗土壤并收集菌体来去除杂质。而在商业化的试剂盒中，通常会有专用的去除杂质的试剂。以 MP 最新推出的 SPINeasy DNA Pro Kit for Soil 为例，红土裂解离心后的上清液（图 2）加入去杂的试剂后，离心后的上清液（图 3）可以做到完全澄清透明。
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图 1 样本裂解前 图 2 裂解离心后上清液 图 3去杂离心后上清液
11、遇到难裂解的土壤样本
土壤中的革兰氏阳性菌以及真菌等因为其细胞壁比较厚，都属于比较难裂解的微生物。另外一些比较特殊的土壤样本比如像沙土中的菌更硬，更难裂解。裂解时间通常为常规土壤样本的 2～3 倍才能完全裂解。
MP 的裂解介质 E 中含有三种不同大小和材质的研磨珠，可以有效针对不同类型的微生物尤其是对革兰氏阳性菌和真菌都能做到有效破碎，尽可能多的获得土壤中的微生物信息。
12、遇到微生物含量少的土壤样本
对于像沙土，沙漠土以及盐碱土这种本身微生物丰度低的样本，可以通过增加样本量来提高提取的浓度。但上样量不要超过裂解管的最大容积，需要给裂解留出充分空间。另外还可以用 PBS 多次洗涤土壤样本来富集菌体。而对于样本的充分裂解也有助于 DNA 浓度的提升。
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MP Bio 土壤试剂盒
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内容审核：潘成
项目审核：周育红
题图来源：图虫创意
图片来源：MP 生物
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