常有研一萌新不懂如何设计引物，好不容易鼓起勇气去问师兄师姐，反倒被数落一番：这是生物实验室最基本的操作，怎么还不懂呢
别担心，今天丁香实验手把手教你如何快速设计引物！
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一、引物设计的原理
PCR 反应特异性扩增的一个关键条件是引物的正确设计，使用不合适的 PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱。
二、引物的用途
合理的引物设计有利于得到特异性的产物。
三、实验材料与仪器
目的基因序列，电脑，引物设计软件。
四、引物设计的原则
1. 引物长度：PCR 的特异性通过引物长度和退火温度控制，一般约为16-24 个碱基。
2. G+C 含量：G+C 的含量一般控制在 40-60% 左右。
3. 碱基随机分布：为避免 PCR 产物的突变，一般不建议 3' 端连续相同的碱基，并且目的片段的某一序列连续多个相同碱基的位置，极容易出现突变。
五、 实验步骤
1. 目的片段的获取
设计引物取决于待扩增的目的片段。设计者在 NCBI 首页的搜索框的下拉菜单中选择 Gene,再在对话框中输入目的基因的名称；选择对应的来源之后，选择对应需要的亚型，将其编码基因的 CDS 区域保存。
2. 引物的设计
引物设计方法有很多种，原则也有千千万万，众多的软件可供选择。如用Oligo7 软件打开保存的序列，将光标拉至扩增序列的最前端，点击 Edit 。里面选择 Edit forward primer，系统默认 21 个碱基，按照 A/T*2+C/G*4 计算引物的 Tm 值，一般 Tm 值在 54-64℃ 之间，可根据这个范围调节引物的长度；调整完成之后将这段编辑后的序列按 5'-3' 的方向复制到 excel 表格中；同样的方法设计后引物并复制到 Excel 表格。
3. 引物的调整
按照质粒构建的方法，在前后引物的 5' 端加上酶切序列（T4 连接酶的方法）或 15-20 bp 的载体酶切位点附近的载体序列（同源重组的方法），按照载体上的酶切序列编码情况，还需要在前引物 ATG 起始前加入碱基以免编码错位，以及确认后引物是否需要终止密码子。
六、引物设计的注意事项
1. 注意正反向引物都是 5‘-3’ 的方向；
2. 注意前引物中可能存在错码的可能以及后引物的提前终止。
七、引物设计的常见问题
1. 引物设计错误，特别是没有注意后引物的方向；
2. 没有注意前引物的移码突变问题；
3. 没有注意后引物终止密码子的问题。
看了小编的讲解，科研新手心中是否有谱了呢？引物设计并不难，在于多总结多分析，在实际例子中积累经验。
当然，更快的方法，就是从其他人的问答中学习经验
提前避坑！
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策划：丁香实验
配图：丁香实验设计团队