常有师弟师妹在实验室哀嚎，为什么 PCR 引物设计这么难？
相信每一个做 PCR 的科研小白都经历过引物设计的捶打，那么如何设计 PCR 引物呢？丁香实验为大家总结了 10 个小技巧。
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一、最好在模板 cDNA 的保守区内设计引物
DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较而确定的，在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman比对Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
二、引物长度一般在 15-30 碱基之间
引物长度常为是 18-27bp，但不应大于 38bp，因为过长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。
三、引物 GC 含量在 40%~60% 之间，Tm 值最好接近 72℃
GC 含量过高或过低都不利于引发反应，因此上下游引物的 GC 含量不能相差太大。此外，上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，有效启动温度应一般高于 Tm 值 5-10℃。
若按公式 Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的Tm为 55-80℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使复性条件最佳。
四、引物 3' 端要避开密码子的第 3 位
如扩增编码区域，引物 3' 端不要终止于密码子的第3位，因为密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
五、引物 3' 端不能选择 A，最好选择 T
引物 3' 端错配时，不同碱基引发效率存在极大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成。而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T之间，所以 3' 端最好选择 T。
六、引物自身及引物之间不应存在互补序列
引物自身不能存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。此外，引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。
七、引物 5' 端和中间 △G 值应该相对较高，而 3' 端 △G 值较低
应当选用 5' 端和中间△G值相对较高，而 3'端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物 3'端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。
八、引物的 5' 端可以修饰，而 3' 端不可修饰
引物的 5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。然而，引物的延伸是从 3' 端开始的，因此不能进行任何修饰。
九、扩增产物的单链不能形成二级结构
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用相关软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。
十、引物应具有特异性
引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
看完以上 10 条攻略，小伙伴们是不是对引物设计更有信心啦？如果还觉得没把握，也可以先从其他人的问答中学习经验哦~
PCR 引物设计和荧光定量 PCR 引物设计的根本区别在哪里？
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策划：丁香实验
配图：丁香实验设计团队