最近常常在实验室看见闷头处理数据、做 PPT 的师弟，跟霜打了的茄子一样。做师兄的不免上去问问缘由，结果发现是免疫荧光图太丑：信号弱、背景高，很难统计出数据。
师弟
师兄，为什么我的免疫荧光总发生意外，周五组会就要汇报了改怎么办啊？
如果发生掉组织或者有杂质，先按照我的 protocol 标准步骤做排查。
师兄
师弟
那如果荧光很弱呢？
从样本本身、固定透化、二抗、拍照，这几个方向排查就好啦！
师兄
师弟
那，背景太高了怎么办？
设置阴性对照，能帮我们迅速判断背景来源。
师兄
别担心了，师兄给你整理了 4 个排查表格，跟着做一次就能有很明显的提升。
师兄
在做免疫荧光实验时，染色问题千奇百怪，让人非常头疼，跟随师兄学习「 4 张表」去进行排查，弄清楚实验中的每一个细节，你也能得到漂亮的结果。
本文内容来自「免疫荧光点亮炫彩细胞」线上的讲座，文末可查看直播回放，码住更多干货内容！
第一张表
规范免疫荧光流程
规范化免疫荧光的每一步操作，才能根据特定样本和实验优化条件，可以有效避免掉组织或者有杂质等基础实验问题。
做好免疫荧光，一般需要以下 5 步：
第二张表
免疫荧光的二抗选择
实验流程容易理解，但是有很多细节都是不可忽略的重点，比如抗体选择问题。免疫荧光的一抗比较固定，按照说明书上的操作进行即可，二抗的选择和使用就有些「讲究」直接决定了染色的背景和信号强弱。
第三张表
排除荧光「信号弱」的原因
挑好合适的二抗后，荧光信号如果还是弱该怎么调整实验？从样本本身、固定透化到抗体孵育，甚至是拍照，每一步都有可能是原因。
第四张表
免疫荧光「背景高」怎么办？
荧光背景也是实验的一个常见问题，如果背景太高了怎么办？操作时别忘了设置对照，这样能帮助我们迅速判断背景的来源。对照包括自发荧光对照（无一抗、二抗）和无一抗对照。
免疫荧光背景排查思路
另外也有小伙伴在问，「浆蛋白信号出现在核里，这是什么缘故呢？」。
出现假阳性信号的原因也非常多，可能原因之一是固定方法不当。使用甲醇、丙酮这些有机溶剂固定可能会导致一些水溶性蛋白粘附到细胞结构上。想要知道更多原因，也可以点击下方卡片，即可观看免疫荧光点亮炫彩细胞的讲座，相信你会有不一样的收获！
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内容策划：那雪妍
内容审核：吴军
题图来源：赛默飞
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