常做 qPCR 实验的师弟师妹抱怨，qPCR 实验就像一门玄学，检测结果总难以达到标准：特异性差、结果重复性差、CT 值毫无规律，想做出一组令人满意的 qPCR 曲线图更是难上加难
！更有研三师兄的论文因实验图曲线异常，被迫选择申请延长回复审稿意见的时间，从头来过补充实验数据……
为了帮助大家少走弯路，我们整理了常见的问题及其解决办法，希望能帮助大家拿到令人满意的数据结果。（文末有福利）
问题 1. 扩增曲线异常怎么办？
正常的 qPCR 扩增曲线一般呈 S 型，CT 值最好在 20～30 之间，不宜偏大或偏小。异常的扩增曲线包括 CT 值偏大、无平台期、平台期下降等问题。
解决方法：模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察 CT 值能否成相应倍数减少。qPCR 反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低。qPCR 体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议改良反应体系。
问题 2. 灵敏度低、特异性差怎么办？
解决方法：许多常见研究样品中含有非常低丰度的靶标，使用适量的模板 RNA，模板量太多会降低特异性，太少则会导致无法检出。
问题 3. 存在批次效应，复孔重复性差，怎么办？
解决方法：加样误差导致，建议移液器定期校准，同时可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
问题 4. 样本复杂且难以提取，稳定性难以保证怎么办？
解决方法：制备效果良好的 qPCR 反应体系，使其在室温下稳定保存 72 小时，尽可能地缩短 qPCR 实验时间，保证 RNA 的完整性和特异性。
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了解之后发现，想要解决以上问题，除了需要细心操作之外，良好的反应体系才是取得稳定结果的关键所在。而实验预混液，更是能反应体系质量的重要标准！一份合格的实验预混液能让实验事半功倍。
赛默飞此次推出的重磅新品预混液，能对标 qPCR 实验中的常见问题，提供有效的解决办法。Applied Biosystems™ TaqMan™ 乾坤™ 白金™ 一步法多重预混液和多重预混液专用于快速、多重、高灵敏度的实时荧光定量 PCR 检测，即使在复杂样本中，也可以得到高质量的结果。此外，它含有 UDG 酶，具有抗污染性，具有较高的桌面稳定性和批间一致性，是生物医药应用和分子诊断的理想选择。现「阅读原文」或识别下方二维码参与有奖调研，即有机会赢取小米电动牙刷等好礼！
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1. 独有的产品专利，实现实验结果高灵敏度：一步法多重和多重预混液均可实现检测下限（5 copies）的稳定检出。
图 1：乾坤白金一步法多重预混液灵敏度检测：在 20 uL 反应中检测到 5 个拷贝和 10 个拷贝的人工 RNA 模板。
图 2：乾坤白金多重预混液灵敏度检测：在 20 uL 反应中检测到 5 个拷贝和 10 个拷贝的人工 DNA 模板
2. 多重性能：一步法多重和多重预混液均能实现多至 5 重的靶标检测，不再担心曲线异常。
图 3：乾坤白金一步法多重预混液 5 重试验：显示了使用乾坤白金一步法多重预混液，人类 RNA 的 ACADM、APOE、GAPDH、RNaseP 和外源性内部阳性对照（IPC）的 5 重反应的线性回归结果。
图 4：乾坤白金多重预混液 5 重试验：显示了使用 TaqMan 乾坤白金多重预混液，人类 cDNA 的ACADM、APOE、GAPDH、RNaseP 和外源性内部阳性对照（IPC）的 5 重反应的线性回归结果。
3. 兼容复杂样本、快速反应、室温稳定：一次性解决样本难以提取、稳定性差的难题，乾坤白金多重预混液可使预构建反应体系在室温中保持长达 72 小时的高水平性能，有效解决样品和试剂稳定性差的难题。针对唾液和细胞粗提物等复杂样品进行检测，也能确保可靠的结果。
图 5：乾坤白金一步法多重预混液粗提物适用性: 图中显示了在处理过的唾液和细胞粗提物中检测外源性病毒和内源性人类 RNA 靶点的结果。
4. 批间一致性高： 完全符合 ISO-9001 质量管理体系，临床实验结果均满足标准。
图 6：乾坤白金一步法多重预混液批间稳定性：使用 4 个不同批次的 TaqMan 乾坤白金一步法多重预混液扩增包括单一和多重反应（多达 5 个靶点）的人类基因表达和人类或动物病毒分析。
图 7：乾坤白金多重预混液批间稳定性：使用 5 个不同批次的 TaqMan 乾坤白金多重预混在不同基因表达靶标和病毒 DNA 靶标之间的批间一致性。
为了不被导师批评、为了投稿顺利、尽快毕业，各位科研人抓紧行动起来，让 Applied Biosystems™ TaqMan™ 乾坤™ 白金™ 多重预混液助你一臂之力！相信一定会有全新的 qPCR 实验体验，助力大家多出好数据、多发好 paper！
内容策划：邹礼平
内容审核：吴军
题图来源：图虫创意
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