师弟
师姐，你的 qPCR 结果我重复不出来
，结果误差太大，到底哪有问题呀？仪器工程师刚调试过，可以排除。
不会是因为基因丰度或模板量低，这批样品我自己之前包括昨天做了都没有问题，你操作过程有污染的可能吗
？
师姐
师弟
我都是在超净台里面操作的，而且我特意检查了有没有残留的抑制物，用 Nanodrop 测了 OD260/280 没有问题。
那你配体系的时候那 1 μl 的 cDNA 咋加的？
师姐
师弟
就.....往里加呗，这还有讲究
？
你别不重视
，1 μl 的体积很小，稍微差一点都有可能影响结果。加样的时候枪头可以伸到液面下一些，也不要没入液面太深，不然液滴有残留实验结果肯定不准。
师姐
师弟
啊？之前真的没想到，我去试试看！
在师姐的指导下，我重做了实验，格外注意了加样的操作，结果真的拿到了满意的曲线图！这周组会终于有数据可以汇报啦
！
大家总说 qPCR 实验是一门玄学，经常埋头苦干一整天，结果就是不理想，其实不然，很多时候是仅仅是一些很小的细节没有注意到，就会整盘皆输。那么如何才能游刃有余地进行 qPCR 实验？怎么优化操作来减小实验失败的概率呢？我们为大家准备了一套有关 qPCR 实验准备和操作全过程的经验包，满满的小 tips，保证实用！
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一、前期保姆式准备，实验期间有备无患！
1. 实验仪器：移液枪、qPCR 仪要定期校准（较准周期一般是 1 年），保证仪器准确性。
2. 引物：引物设计后进行有效性验证，选取扩增效率在 90%～110% 之间，且融解曲线单峰的引物，保证其高效的扩增效率和特异性。
3. 内参：如何选择、如何验证？
选择：
（1）通过已发表文章查找相同物种的内参，在实验体系上进行测试；
（2）选择常见的内参，在实验体系上进行测试；
（3）内部控制基因（Internal Control Genes，ICG）库中查找内参。
验证：
（1）尽可能选用多个内参同时进行实验；
（2）通过在不同样本处理上的表达差异检测情况，来选择合适的内参，选择差异不显著的内参作为后续实验内参；
4. 样品 cDNA ：cDNA 模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量?
没有具体的稀释参考倍数，理论上 cDNA 每稀释 10 倍 CT 值变大 3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用 cDNA 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液等梯度稀释模板进行定量实验，根据规律选择 CT 值落在 18~28 范围内的稀释倍数。
注：当使用 cDNA 原液进行检测的时候，使用量不能超过 qPCR 反应体系的 1/10，因为 cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的组分，过大体积会抑制反应的进行。
二、提前排版 + 预混，准确加样不糊涂！
举个例子
：
1. 实验目的：比较未处理（对照组）和经处理后（处理组）的样本中某基因的表达变化。
2. 实验分组与排板设计：
对照组和处理组除目的基因检测还需引入内参和 NTC（无模板阴性对照，用于排除实验体系中是否存在污染），每个处理做三个复孔，排板如下：
3. 实验体系（以 Vazyme #Q712 推荐加样体系为例）：
4. 体系配置方案：
（1）采取大体积配置试剂预混 Mix 溶液，可以增加复孔的重复度，减小误差。
Mix 1 两管：qPCR Mix + 引物 [内参（含 NTC）/ 目的基因（含NTC）]
Mix 2 两管：水 + cDNA 模板（对照组 / 处理组）
（2）处理组、对照组每孔加样体积：10.8 µl（Mix1）+ 9.2 µl（Mix 2）
NTC每孔加样体积：10.8 µl（Mix 1）+ 9.2 µl（ddH2O）
注：
① 一般会多配一些样品，这样保证最后每个孔都能有同等体积的液体；
② 预混后要涡旋离心，使其混匀；
③ Q712 为通用型试剂，无需在不同仪器上调整 ROX 的浓度。若所用试剂为非 ROX 预混型试剂，且仪器需要 ROX 进行校正（如 ABI stepone），需要在加样时注意添加 ROX。
5. 加样小 tips：
① 加样环境：qPCR 实验反应灵敏度高，所以配置预混液的过程应均在超净工作台中进行，防止污染；
② 配置条件：预混试剂在冰上操作，并避免强光直射，减少体系配置过程中导致模板降解、酶活降低以及荧光淬灭的可能；
③ 加样顺序：先加大体积，再加小体积液体；先加 NTC，再加模板。减小操作误差和污染风险；
④ 加样方式：
➣ 小体积加样可以采取移液器二档吸液一档出液（也就是说按到底吸液，出液的时候不要按到底），若不进行枪头更换，下个孔就是一档吸一档打，这样可以提高加样精确度和复孔的重复度；
➣ 如果离心管已有液体了，再加小体积的时候，把枪伸到液面下打，可以避免液体在枪头内残留；
➣ 吸液体的时候枪头不要没入液面下太深，并选低吸附枪头，减少枪头吸附引起的误差。
三、机器程序检查全面，不放过任何细节！
以诺唯赞 Q712 反应程序、ABI Q3 仪器进行设置为例：
1. 上机前检查：
✔ 注意管材中有无气泡，若存在气泡需轻轻弹去，然后瞬时离心；
✔ 不要在管口对准的管盖部分做标记，影响荧光信号采集。
2. 上机程序设置检查：
✔ 检查程序设置的温度、时间、循环次数、检查反应体积是否填写正确，以及是否设置荧光采集，否则会出现无扩增曲线的情况；
✔ 仪器类型不同，融解曲线采集程序不一定相同，使用仪器默认融解曲线采集程序即可。
四、数据无脑计算表格，照着来就老 OK 了！
怎么样
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全平台通用：特殊参比的 ROX 染料，适用于多种 qPCR 仪器，无需在不同仪器上调整 ROX 浓度
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内容策划：王丹琦
内容审核：吴军
题图及文中图表均来自诺唯赞
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