师妹
师兄！我的组会结果图被导师痛批一顿，求支招～
是我带你做的病毒蚀斑实验吗？哪一步出现了问题？
师兄
师妹
多孔板边上的孔总会有边缘阴影，拍了好多次都不行。
病毒蚀斑实验中，蚀斑的大小、分布、边缘情况都可以反应病毒生长和毒力因素。实验结果图模糊不清会导致实验结果不可信，这种错误可是会被拒稿的。
师兄
师妹
那这个实验要怎么优化呢？
先按照以下步骤规范实验操作，师兄再带你拍照。
师兄
病毒蚀斑实验是指当病毒感染细胞后，由于固体覆盖层的限制，释放的病毒只能从最初感染的细胞向周边扩展，经过几个周期的增殖，形成一个感染病变细胞聚集的区域，即为病毒蚀斑。蚀斑形态在不同的生长条件下和病毒种类之间存在显著不同。
蚀斑实验基本步骤
1. 宿主细胞的培养：将宿主细胞在多孔板中培养到汇合度 90% 以上。
2. 固体覆盖层的配制：可选用 0.6% 琼脂糖，2% 羧甲基纤维素（CMC）或 2.4% 胶体微晶纤维素（avicel）的水溶液，使用前应高压灭菌，室温密封保存。
3. 病毒的稀释与感染：将不同稀释倍数的病毒感染液与宿主细胞共培养，之后弃去病毒感染液，加入固体覆盖层继续培养。
4. 固定与染色：使用 10% 甲醛溶液进行固定，之后弃去固定液，用 0.5% 结晶紫溶液进行染色，待结晶紫充分自然渗透后，用水洗去浮色。
5. 拍照并计算分析：对染色后的多孔板进行拍照，计算每个孔中的蚀斑数，取相同稀释度重复样品的平均值计算病毒滴度。计算公式为：蚀斑形成单位（PFU/mL）= 平均蚀斑数/（稀释倍数 × 病毒感染液体积（mL））
图 1. 病毒蚀斑实验示意图
（上下滑动查看）
实验的最后一步——拍照也大有讲究，实验图像的质量高低决定着结果的真实性与论文质量，没有完美 Figure 图的论文如何入得了审稿人的「法眼」。
师妹
师兄，怎么才能把多孔板拍的清晰漂亮啊？
楼上新买了一台 Amersham ImageQuant 800，不仅可以拍多孔板，还能拍培养皿，拍出的图是彩色的、没有边缘阴影。除此以外，还可以用 IQTL 分析软件对拍照结果进行计数。
师兄
师妹
太方便了，师兄你快教教我。
操作流程都帮你整理好啦，一起看看吧！
师兄
Amersham ImageQuant 800 选配的 NP 透镜模块包括 NP 透镜和透镜导轨。
拍摄时，先将透镜导轨放置在透明样品盘中，再将多孔板放在导轨中心开口处，之后将透明样品盘放入下层样品仓，最后将 NP 透镜插入下层托盘并推到底。
在屏幕上，选择 Colorimetric 模式中的 OD measurement 进行拍摄即可。
图 2. NP 透镜成像
师妹
哇！灰色阴影果然不见了，这蚀斑结果图好漂亮！
别急，把图片在分析软件 IQTL 的 Colony Counter 中打开，还能让软件帮你计数呢！
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师兄
图 3. IQTL 的克隆计数功能界面
使用 IQTL 进行克隆计数的步骤具体如下：
1. 选择 Colony Counter 功能，在 Image 中打开需要分析的图片。
2. 在 Detect 中左键框选需要计数的区域，调整右侧灵敏度，斑点直径等滑块，直至想要计数的斑点绝大部分都被识别。
3. 在 Edit 中，使用 Draw 和 Delete，添加或删除图中计数的斑点，用 Split 分割连接在一起的斑点。
4. 在软件右上角读取计数和浓度分析结果。
师妹
太好用了！师兄，我悟了，那我做细胞克隆形成实验也可以用 Amersham ImageQuant 800 拍照，用 IQTL 软件分析了？
你太厉害了，都会举一反三了。这个仪器能够对多种样品类型进行成像，包括凝胶、印迹膜、多孔板和培养皿等。检测范围包括化学发光、荧光和白光成像。
师兄
Amersham ImageQuant 800 系统适合多用户环境，可对多种样品类型进行成像，包括多孔板和培养皿。专用配件，如 NP 透镜，帮助用户获得无边缘阴影效应的高质量成像结果。
此外，ImageQuantTM CONNECT 软件可远程访问图像库，并可预约空余机时；一体化高清触摸屏和外置 mini-PC，智能化设计，节省空间，灵活度更高。
如您对 Amersham ImageQuant 800 成像仪感兴趣，可以识别下方二维码或点击阅读原文下载成像仪详细资料，还可以申请机器试用！
内容策划：那雪妍
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意
参考资料：
[1]. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., & Drebot, M. (2020). Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology2020,57(1):cmpc105, doi: 10.1002/cpmc.105
[2]. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. JoVE2014, (93), e52065, doi:10.3791/52065 .
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