「真的，我想哭了！RT-qPCR 实验结束，总能发现有些样本的 Ct 值明显延后，有几个甚至没有扩增，明明每一步都按照 SOP 规范操作，怎么就出来这么一个结果呢，也不知道哪个步骤出错了，无从下手，真是让人头大......」
屋漏偏逢连夜雨，偏偏导师还来问我实验进展：
导师
你的实验进展怎么样了？
不太好，有些样本的扩增结果不好。
我
导师
按照你师姐给你的 SOP 操作了吗？
我按照 SOP 里的实验步骤一步步操作，结果就是不太好。
我
这时候师姐也来凑热闹。
师姐
我看师弟之前做了性能验证，方法上应该没问题，基因表达分析实验的起始步骤是 total RNA 提取，提取产物有没有检测？
用分光光度计检测了，都是正常的。
我
师姐
那 RNA 完整性测了吗，样本抑制物检测做了吗？
我......没做过。
我
后来，师姐完整地教了我一遍，并给了我下面这份「不外传」的秘密宝典。
一、样本质量是 RT-qPCR 实验成功的关键因素之一
使用高纯度（不含 DNA 和蛋白质及抑制物）和高度完整（无降解）的 RNA 进行实验是整个 RT-qPCR 实验流程中很关键的环节。降解或污染的 RNA 会产生低质量的 cDNA，从而导致 qPCR 反应效率低下，并导致不准确的低质量数据，具体表现为：
● RNA 不纯将导致对下游 PCR 反应的抑制，Cq 将右移，产生数据偏差。
● 若 RNA 发生降解，将导致不正确的结果。
● RNA 的纯度和完整性是不相关的两个指标，都需要进行检测以确保高质量的 RNA 用于下游实验。
对于 RT-qPCR，要尽力避免所谓的「garbage in = garbage out」。获得高品质 RNA 需要注意：
1、尽量避免 RNA 酶污染，使用无 RNA 酶的耗材和试剂，戴手套口罩，建议将提取和扩增的场所分开。
2、尽量减少采样时间，样品处理后快速冷冻，可以加入 RNA 保护剂。
3、RNA 提取过程中可以使用 RNA 酶抑制剂。
4、样本存储过程中避免反复冻融。
5、必要的情况下，分装 RNA，并在乙醇或异丙醇中于 -80 ℃ 下保存。
二、RNA 样本质量评估方法
判断一份样本是否合格，需要考察 RNA 浓度（总量）、RNA 纯度、RNA 完整性、抑制物（污染物质）等方面。常用的方法如下：
1、UV 吸光度检测
260 nm 吸收值计算 RNA 浓度，再乘以体积可以计算 RNA 总量；测量 260 nm/280 nm 吸收值的比值，用于评估 RNA 纯度，纯度的要求如下：
● A260/280 = 2（1.8～2.2；＜1.8，说明有蛋白质残留；＞2.2，说明 RNA 可能发生降解）
● A260: 0.15～1
● A260/230 = 2.5（> 2.0）
2、电泳分析 RNA 条带
通过琼脂糖凝胶电泳可以大致评估 28 S 和 18 S 的比值，用于检测 RNA 完整性。判断合格的标准是 28 S 和 18 S 条带明亮、清晰，且 28 S：18 S ≈ 2：1；如果 RNA 降解，则会出现弥散状条带；如下图所示：
图 1. RNA电泳条带
但电泳分析 RNA 质量存在以下不足：
● 需要相对大量的 RNA（5～10 μg），当 RNA 总量较低时，可能无法开展。
● 肉眼评估，比较主观
● 耗时长，耗费工作量
● 通量低，不适合大量 RNA 样本分析
● 不能反映是否存在 g DNA 污染
3、微流体毛细管电泳系统（分析 RNA 浓度和完整性）
目前已经有成熟并广泛应用的生物分析仪，如 Agilent 2100、Experion™ 自动电泳工作站等。
此外还可以采用 3`:5` assay（检测提取产物中 GAPDH mRNA 的完整性来代表所有 RNA 的完整性，分析 RNA 完整性）、SPUD assay （分析 PCR 抑制剂）、NRT PCR assay（分析 gDNA 残留）等等。
值得注意的是，RNA 的纯度和完整性是两个不相关的指标，两者没有必然的内在联系，不能想当然的认为分光光度计结果正常， RNA 完整性就没问题。我们来看一个例子：从人肝癌样本提取总 RNA，在 90 ℃ TE 缓冲液中孵育不同的时间，同时进行 RNA 纯度检测，发现均合格。
表 1. 肝癌 RNA 样本浓度和纯度的检测结果
但 Experion Virtual Gel 电泳结果显示，6、7、8 号样本发生了严重降解。所以分光光度计结果正常并不意味着 RNA 完整性就好。
图 2. RNA 电泳结果
三、如何判断 RNA 样本存在抑制物？
提取纯化 RNA 具有挑战性，因为各种细胞和组织中普遍存在核糖核酸酶（RNase），它们会迅速降解 RNA。此外，尿素、盐、苯酚、肝素等抑制性成分和在取样或 RNA 提取过程中使用的试剂残留也可能会影响 PCR 结果。有调查表明，只有 6% 的研究人员测试他们的核酸样品是否存在抑制物，抑制物检测是时候引起大家重视了。
Tania 等人开发并改进了一种方法，称之为「SPUD」测定法。SPUD 可以鉴定 RNA 或 DNA 样品是否存在抑制剂。当需要分析大量样品时，或者当目标基因的低拷贝数较低时，不能梯度稀释样品时，该检测方法特别有用。该试验可以避免假阴性，并使得阴性结果的数据报告更为可信。
SPUD assay 一般由人工模拟模板和一对特异性引物组成，在染料或探针的作用，扩增 SPUD 模板，产生特征性 Cq。纯净样品的 Cq 与 SPUD 对照相同，而在被污染的样品中，Cq 值将升高。如下图所示：SPUD + RNA2 与对照 Cq 值相差为 3，则可判断提取产物含有抑制物，且不能忽略。
图 3. SPUD 检测 RNA 样本中抑制物的原理
通过 SPUD 试验检测 PCR 抑制物的实例：
（A）从 HeLa 细胞提取 RNA 的扩增曲线图，加入纯水的对照（a）、模板 RNA（b）以及存在痕量抑制物苯酚（c）。
（B）从福尔马林固定石蜡包埋包埋样品（FFPE）提取的 RNA 和纯水（W）下进行 SPUD 试验，30 个样品中有 5 个存在显著的抑制。
图 4. SPUD 应用实例
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* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。
内容审核：邹礼平
项目审核：周育红
题图来源：图虫创意
参考资料：
[1]. Taylor, Sean C., et al. The ultimate qPCR experiment: producing publication quality, reproducible data the first time.[J] Trends in Biotechnology 37.7 (2019): 761-774.
[2]. Nolan, Tania, et al. SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations.[J] Analytical biochemistry 351.2 (2006): 308-310.
[3]. Bio-Rad Bulletin 5279:Real-Time PCR Applications Guide
[4]. Bio-Rad Bulletin 6894:Tips, Tricks & Best Practices The Ultimate qPCR Assay Design Guide