重新做了转染实验，效率还是不行，实验一直卡在转染这一步，导致后续实验无法进行，我又又又 emo 了……
什么是细胞转染？
为什么会出现转染效率低？
转染实验应该注意什么？
大家是否也遇到过类似的问题？不用担心，针对以上问题我们准备了一份超级详细的「转染攻略」，没有废话，全是干货，一定要看到最后！（文末还准备了福利哦）
转染攻略之：
4 种转染方法「头对头」比较
细胞转染是指将外源分子如 DNA、RNA、蛋白质等导入到真核细胞的技术。随着基因和蛋白功能的深入研究，转染已经成为科研实验中最常用的技术手段之一。
细胞转染技术主要分为三大类：物理介导法、化学介导法及生物介导法，详见图 1。
图 1 四种细胞转染方法汇总
理想的细胞转染方法应具有转染效率高、细胞毒性小及重现性好等特点。目前常用的转染方法有阳离子聚合物转染、脂质体转染、电穿孔和病毒感染，不同的转染方法各有利弊，没有一种转染试剂是普遍适用的，我们需要依据自己的实验需求选择合适的转染技术及转染试剂，才有可能得到理想的实验结果。常用转染方法的原理，特点和适用范围详见表 1：
表 1 四种常见转染方法比较
转染攻略之：
5 个问题全面解答
做转染实验时，除了要选择合适的转染试剂，要想获得最优的转染效果，还需要对转染条件进行优化。细胞转染效率往往受到很多因素的影响，比如细胞状态和密度、培养基、质粒等，所以细胞转染是一个常规但并不简单的实验。这里我们以阳离子聚合物转染试剂为例，一起了解一下在转染过程中需要注意哪些因素吧！
（1）细胞状态
细胞状态不好，会导致转染效率低下，为确保良好的细胞状态需注意以下几点：
a. 转染实验前，细胞解冻后传代 3～4 次；
b. 使用活性 > 90% 的细胞,可通过台盼蓝染色等测定细胞活性；
c. 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长，多数情况下，当细胞汇合度达到 60%～80% 时转染效率较高。
（2）使用优质 DNA
为实现高效率、低毒性的转染，应使用高质量的 DNA（高纯度、无菌、无内毒素）。
a. 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备 DNA；
b. 测定 DNA 纯度，OD 260/280 值应介于 1.7～1.9 之间，越接近 1.8 越好；
c. 使用无 DNA/RNA 酶的水或 TE 稀释 DNA。
（3）载体构建
若质粒基因产物对细胞有毒害作用，则转染难以成功。转染载体的构建选择可调控，强度合适的启动子很重要，可以以空载体或相同载体的其他基因为对照排除毒性对细胞的影响。
（4）优化转染试剂/DNA 的比例
不同细胞系转染效率通常不同，需要进行预实验，选择合适浓度的 DNA，调整 DNA 与转染试剂的比例，以获得较高的转染效率。
（5）防止污染
细胞污染也会造成转染效率低下，为防止细胞污染应注意：
a. 培养物污染
培养物可被细菌、真菌、病毒、支原体或其他细胞种类所污染，各种污染均会导致结果错误。
b. 支原体污染
支原体污染一般难以察觉，培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，包括酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。因此，必需进行支原体污染的常规筛查。
c. 交叉污染
如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。当怀疑有交叉污染时，如果有可能，就换用新鲜的，传代次数少的细胞源。
转染攻略之：
2 个方法助力效率验证
转染完成后需要对转染效率进行验证，常用的转染效率验证方法有以下两种：
1、利用含 GFP 或 RFP 之类报告基因的质粒作为阳性对照，评估转染效率。
使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和 GFP 蛋白表达细胞的百分比。
a. 转染后 24～48 小时，即可以检测到质粒的表达。
b. 阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与目的质粒共转染。
2、利用 qPCR 法精确定量目的基因。
选择合适的转染试剂，并进行规范操作，老板再也不用担心你的细胞转染效率低了！
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内容审核：邹礼平
项目审核：吴军
题图来源：图虫创意
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