最近常常在实验室看见闷头处理数据的小师妹，原本朝气蓬勃的小美眉，这几天跟霜打了的茄子一样。
做师姐的不免上去问问缘由，结果发现是 real-time PCR，实验进展不顺利。
谈谈引物二聚体为何出现
小师妹碰到的引物二聚体问题是 QPCR 实验中最常见的问题之一。其原因是引物对之间的部分序列存在同源性。
怎么判断自己的 QPCR 出现了引物二聚体？
可以用熔解曲线（又称解离曲线）和凝胶电泳来完成。熔解曲线，是结合染料的双链 DNA 解离或“熔解”成单链 DNA 时，观察到的荧光强度的变化，比如小师妹做的这张图：
（熔解曲线： real-time PCR handbook from ThermoFisher）如果扩增特异性良好，则解离曲线将出现一个较窄的单峰。而引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽较低的“波形”（见师妹熔解曲线图中，在 70°C 左右）。
NTC 扩增了又是怎么一回事？
而 NTC 是指无模板对照——即用水代替荧光定量 PCR 反应中的核酸。其他的试剂按比例正常加入，用于监测反应体系中的污染。正常情况下，NTC 孔中不会有扩增。当 NTC 孔出现扩增时，则预示体系中可能有污染。
（扩增曲线：图来自real-time PCR handbook from ThermoFisher）除了以上两种异常曲线还有其他 4 种快进来看看有你的问题吗？👇👇👇
回到引物二聚体的问题，怎么解决？能避免么？
引物二聚体解决方法首先，最好在引物设计阶段就能采取简单的预防措施，从一开始即避免二聚体的形成。有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体.
我列举了 5 种常见方法，解决引物二聚体，点击下方卡片立即查看。
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听了师姐的讲解你还是担心做不好，毕竟还有那么多坑呢，常见的不常见的，简直「坑死了。」稍安勿躁，看到这里怎么好让你空手而归呢？
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策划｜Olaf
作者｜木兰
配图｜丁香实验设计团队