小师妹
师兄，用 Ficoll 进行人外周血中淋巴细胞分离时，淋巴细胞所处的位置以及各层细胞的分布我搞不太明白， 我快被折磨死了。
师兄
不用着急。看下面这个图你就知道了。离心完成后，从管底往上依次为：红细胞-粒细胞-Ficoll 细胞分离液-淋巴细胞-血小板-血浆。一般要先小心地将上层的血浆和血小板移除后再吸取淋巴细胞。
小师妹
可是师兄！分离后发现得到的淋巴细胞中有较多红细胞污染咋回事？
师兄
师妹，你有没有控制离心时的温度？离心机温度太低可能导致这样的情况发生。Ficoll-Paque 是一种密度梯度离心介质。在低温条件下，Ficoll-Paque 的密度较高，因而红细胞的聚集效果比较差，离心时红细胞和粒细胞不能很好地穿透 Ficoll-Paque 层而造成分离后的淋巴细胞有红细胞污染。合适的分离温度应保持在 18～20 ℃。
小师妹
完了！芭比 Q 了！我一直都是用的低温离心，维持细胞活性......师兄你在分离单核细胞的时候还有什么经验，快把绝招分享给我！
师兄
那我可得跟你唠唠了！目前我们实验室用到的细胞分离产品主要分 Percoll 和 Ficoll 两种...... （除了干货内容，文章结尾还有惊喜促销哦）
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图注：Percoll 密度梯度培养基
图注：Ficoll 密度梯度培养基
Percoll 的应用范围较广，不仅仅适于分离多种属不同密度的细胞，还可分离亚细胞器和病毒，可实现从 1.0～1.3 g/ml 范围内的密度梯度离心分离。Ficoll 主要有 3 种密度，1.073、1.077、1.084 g/ml，主要用于人血，骨髓，以及脐带血中一些单核细胞、间充质干细胞的分离。Ficoll（1.084 g/ml）主要用于小鼠或大鼠血液淋巴细胞分离。
上述信息简而言之，以表格的形式呈现如下：
接下来就分享 5 个细胞密度梯度分离液操作小 Tips：
1. Ficoll 分离人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclearcell，PBMC），血小板污染比较多，如何改善？
可以从以下六个方面降低血小板的污染：
（1）不管用哪种离心管，都需要严格保持样品的高度/ficoll 的高度比为 3/2.4；
（2）离心温度应控制在 18～20 ℃；
（3）取目的层样品时，需先将上层溶液去掉，再吸取目的层；
（4）增加分离后的洗涤步骤；
（5）分离后洗涤时，可以在较低的离心力情况下（比如 200 g）进行离心处理，血小板密度比较低，会留在血浆中，PBMC 在沉淀里，通过这一操作可以除掉一部分血小板；
（6） 考虑起始血液样品本身是否正常、是否新鲜。
2. Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞产量低 、活力低且出现其它类型细胞污染？
多半是由于样品含有非正常密度的细胞。这些细胞的密度不同于那些来自正常人血液中细胞的密度，比如非正常血液样品、非人血液样品，或非外周血来源的样品。在这些情景下，Percoll 可能比 Ficoll-Paque PLUS 更加适合此类样本的分离。
3. Ficoll 分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞产量低但活力正常 ？
在分离时，未用平衡盐溶液将血液稀释到 1:1；通常情况下，红细胞比容较高，高细胞密度导致大量的淋巴细胞陷入红细胞团块中，此时应进一步稀释血液样品。
4. Ficoll 分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞低产量且粒细胞污染增加？
可能是由于离心机转子振动，导致梯度混合。离心机转子振动可能导致淋巴细胞带的增宽，与下层细胞混合。应先检查转子是否已平衡，再选择合适的转速，以避免自发共振频率。
5. Percoll 的配制方法有哪些？
（1）按照百分比用两步法计算：用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液，得到 100% 的 SIP 溶液。在此基础上，比如想要得到 44% 和 67% 的工作液，分别按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖：SIP =（100～44）：44 和（100～67）：67 的比例取相应体积的溶液进行配制即可。
（2）根据密度进行一步法计算，该计算方法需要知道最终配制的溶液的密度、细胞分离液的密度（Percoll 密度范围 1.130 ± 0.005 g/ml，具体密度可根据批次号在 Cytiva 官网中查询 COA 获得），以及用于稀释的 buffer 的密度（1.5M 的 NaCl 密度为 1.058 g/ml，2.5M 的蔗糖的浓度为 1.316 g/ml），推荐官网的计算小程序，链接如下：
https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/online-tools/cell-preparation/Percoll-calculator
小师妹
谢谢师兄，小本本都记好了！
心动不如行动吧！
师兄
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答
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内容审核：王丹琦
项目审核：周育红
题图来源：图虫创意
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