小师弟
师姐，我今天做的 Weatern blot 有结果了😭
师弟你这背景太脏了啊，样品杂质太多，要用大孔径的膜，你去拿新的膜重做一下。
师姐
小师弟
为什么我每次都翻车，而且还都不是一个地方😰
师姐就是在 WB 的历练下从小白蜕变到实验高手的，回看就是满满的血泪史……
师姐
（文末含惊喜促销福利）
WB 整个流程看似非常简单，但在实验中总会遇到各种各样的问题，比如：无特异性条带、条带信号太弱、背景信号太高，其中非常常见的问题是背景高！那么究竟如何才能做出完美的结果图呢？掌握以下 7 个要点帮你轻松降低背景，搞定 Weatern blot 实验：
1、实验样品的预处理
通常做实验时拿到的蛋白提取液，可能会有一些提取过程中残留的盐分和表面活性剂等组分，可能对后续 WB 实验产生特定的干扰，同时样品提取过程中或提取后需要加入一些蛋白酶抑制剂和核酸酶混合物，降低蛋白的降解和核酸杂质的干扰。
可以试试它们
SDS-PAGE 电泳样品去盐除杂试剂盒
蛋白酶抑制剂混合物
核酸酶混合物
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2、转印膜的选择
WB 实验中最关键的是转膜这一步。常用的转膜介质有 PVDF 膜和 NC 膜。NC 膜因为使用简单，适用于化学发光，荧光显色等各种显色方法而使用最为广泛。PVDF 膜对于蛋白的结合力高于 NC 膜，选择蛋白结合力更低的 NC 膜可以更好地降低背景信号，此外 PVDF 膜的机械强度和化学相容性更好，所以是蛋白质测序时的唯一选择。但 PVDF 膜不适合做荧光显色，此外在使用前需要用甲醇预处理后再放到缓冲液里平衡。两种膜的孔径有 0.45 和 0.2 um 等几个规格，还有对应孔径且经过特殊低背景处理的 PVDF 膜和 NC 膜，也可以极大降低我们使用化学发光、近红外荧光和荧光检测的背景信号，降低信噪比，在使用时可以根据自己的需求选择相应的膜。
常规或低背景 0.1/0.2/0.45 PVDF 和 NC 膜
Tips：
通常 NC 膜可用于 WB，荧光 WB。
而 PVDF 膜更多常用于 WB，不用于荧光 WB。
3、更高通量的转印仪
WB 实验的转膜方式主要有湿转和半干转两种，两者原理相同，只是用于固定胶/膜叠层及施加电场的仪器有所不同。半干转耗时短，但是更适合小分子蛋白的转印，而湿转蛋白分子量范围较宽，但消耗的时间比较长。想要极大节省 WB 转印时间，可以选择快速半干转系统（10 min）取代常规的湿转（60 min）。但是，在快速半干转过程中，会瞬间产生极大的热量，转印条件非常苛刻，有可能会影响蛋白的状态，从而导致后续实验各种问题。因此可以选择常规半干转系统（20～45 min），缓慢产热和散热降低对蛋白的影响。我们还可以从转印面积和通量上优化，选择更大转印面积的半干转仪器加速我们的实验进程。
此外，如果我们的蛋白稳定性弱，快速半干转急速产热，很容易影响蛋白的状态，盲目更换快速半干转则会「欲速则不达」。因此在保证蛋白稳定的前提下，选择高通量湿转系统也是提高实验效率的不错选择 !
TE22 湿转仪
TE77 PWR 或 TE70 PWR 半干转仪
4、选择无需排气泡的转印滤纸
常规我们都会在转膜介质与凝胶的两侧各加三层滤纸，也就是经典的三明治模型，但是在滤纸叠加过程中，很容易气泡排不干净，影响转印效果。因此需要选择更合适的滤纸可保证转印过程中的缓冲液充足。
GB005 滤纸
5、封闭不完全
转膜结束后需要进行封闭。这一步是为了将转膜介质上为结合蛋白质的部位利用无关蛋白覆盖掉，防止在后续孵育抗体时抗体直接结合到膜上造成假阳性。通常实验室使用 5% 的脱脂牛奶溶液进行封闭，简单便宜。但这类封闭试剂存在杂质，可能造成背景信号偏高。为了得到更好的结果图，除了尝试用 BSA 或脱脂牛奶等常规的封闭试剂外，可以考虑商品化的封闭剂，并适当延长封闭时间。
ECL 封闭试剂
6、一抗或二抗的非特异性结合
完成封闭后要孵育一抗、二抗来使目的条带显色。一抗和目的蛋白结合，而二抗通常携带辣根过氧化物酶（HRP）结合一抗催化底物反应达到显色目的，最终指示目的蛋白条带，因此一抗和二抗的特异性非常重要，选择特异性强一抗是 WB 实验成功的关键，同时也能降低背景信号。此外还要考虑二抗与一抗的匹配度。选择正确的一抗和二抗之后，也需要摸索合适的抗体的浓度和孵育时间，合理的抗体浓度和孵育时间会降低背景信号，缩短实验时间。
HRP 标记二抗或 CyDye 700/800 近红外二抗
7、检测
一抗、二抗孵育完毕后，经过简单的漂洗去掉未结合目的蛋白的残留一抗、二抗后，就可以添加显色液进行检测。通常蛋白丰度越低需要的曝光时间越长，但相应的背景信号也会越强。对于较难检测的蛋白需要更长的曝光时间，但是就会造成背景信号偏高，可以选择灵敏度更高的发光液来满足实验需求。
ECL 发光液
Cytiva 专注于生命科学和生物技术的研究，提供 Weatern blot 实验全站式服务。Cytiva 提供 0.45 和 0.2 um、经过特殊低背景处理的 PVDF 膜和 NC 膜，同时可以提供去盐除杂试剂盒、蛋白酶抑制剂，核酸酶混合物等助力样品预处理过程；
对于转膜过程，GB005 滤纸专门用于 Weatern blot 实验，厚度 1.5 mm 比常规滤纸更厚，可以充分保证转印过程中的缓冲液充足。此外 Cytiva 具有高通量（1-4 块胶）TE22 湿转仪以及 TE77 PWR 或 TE70 PWR 半干转仪，转膜面积大，散热效率高，具有很好的转膜效果，几款转膜仪器可以满足所有转膜方式。
此外 Cytiva 还有 ECL 封闭试剂以及各类 HRP 标记二抗或 CyDye 700/800 近红外二抗，具有高特异性能有效降低背景信号，检测不同丰度的蛋白条带。
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内容审核：周育红
题图来源：曾家伟
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