近年来，免疫学研究在癌细胞领域取得了令人瞩目的进展。免疫检查点抑制剂（ICIs），PD-1 以及新型细胞疗法（如TILs，Car-T，Car-NK，TCR-T）等方法已经使癌症患者真正受益。
肿瘤免疫学涉及多项细胞分析研究，包括细胞活化、增殖和活性（健康、死亡、凋亡等）研究，监测免疫细胞和癌细胞共培养时发生的免疫细胞杀伤、癌细胞的吞噬及清除等事件，以及细胞迁移、浸润和趋化作用等。而细胞的体外研究对于探索肿瘤发生的机制，评估新型潜在治疗方法来说至关重要。
高通量、智能的新型生物分析技术为肿瘤免疫学赋能，大大加速、简化肿瘤免疫学研究中的体外细胞分析。Incucyte® 实时活细胞成像分析是一种基于延时、相差显微镜和荧光成像的无创性细胞监测与测量方法，能够对免疫细胞及癌细胞的生物学活动提供全程可视化监测和定量分析。iQue® 高通量流式细胞仪，可快速进行高通量的蛋白分析、免疫表型、功能评估和分析，包括抗体筛选及免疫细胞激活。相比于传统流式，此方法可以在单个孔中同时测定细胞表型变化、增殖及细胞因子分泌等特异性参数，并且能够自动进行可视化数据处理。
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在此，小编汇总了两个技术在肿瘤免疫学中的 4 个应用案例，一起来看看吧！
Incucyte® 实时活细胞分析应用
图 1. 用于肿瘤免疫学研究的 Incucyte® 实时连续活细胞分析。
案例 1：免疫细胞杀伤分析
曲妥珠单抗（赫赛汀®）是一种临床上用于治疗 HER2 阳性实体瘤的单抗。为了比较其与潜在的单抗生物仿制药的抗体依赖性细胞杀伤（ADCC）能力，使用 Incucyte® 实时活细胞成像分析 HER2 阳性 SKOV-3 卵巢癌细胞和 PBMCs 的共培养物（图 2，3）。
图 2. 实时活细胞成像采集。免疫细胞（PBMC）杀伤 SKOV-3 卵巢癌细胞的连续影像剪辑。（1）、（2）免疫细胞入侵癌细胞；（3）肿瘤细胞死亡、颗粒化及 Caspase-3/7 绿色信号；（4）肿瘤细胞分裂。
图 3. 自动数据分析，量化曲妥珠单抗及生物类似物的 ADCC 能力。（A）使用 IncuCyte® Caspase-3/7 绿色染料测量肿瘤细胞数和凋亡；（B）靶细胞死亡的时间与浓度反应曲线图（浓度单位为ng/mL）。（C）四个 96 孔板的全景视图；（D）结果数据分析。
结果表明使用抗 CD3 | IL-2 活化 PBMC 引发细胞杀伤。曲妥珠单抗对细胞增殖起到抑制作用（其 IC50 值为 8 ng/mL），并有时间和浓度依赖性，并且伴随着凋亡性肿瘤细胞死亡的增加。三种生物仿制药单抗均可产生与曲妥珠单抗相当的杀伤效果（IC50 值均在 5～9 ng/mL 的范围内）。Z'值的范围在 0.63～0.83 之间，验证了分析可靠性。采集的图像证实了肿瘤细胞的免疫攻击及凋亡细胞的形态学特征。
案例 2. T 细胞趋化性实验
肿瘤相关趋化因子（如 CXCR-4 配体 CXCL-12）在癌症生物学中起着关键的作用，可促进白细胞侵袭、肿瘤生长及免疫逃逸。CXCR4 介导的趋化性是 T 细胞和其他免疫细胞被吸引到肿瘤微环境中的关键机制。使用 Incucyte® 和 Clearview 96 孔板（每个孔中均有方便细胞通过的精密激光钻孔）对T细胞趋化作用进行 24 小时实时连续监测（每 30 分钟自动收集一次相差图像（10 倍镜））（图 4）。
图 4.（A，B）使用 Incucyte® 监测 CXCR4 介导的人类T淋巴细胞趋化作用。细胞（黄色箭头所示）经激光钻孔（黄色圆圈）向 SDF-1α 化学引诱剂迁移。（C）SDF-1α浓度依赖性细胞趋化作用随时间的变化。（D）从四组独立实验中获得的 SDF-1α 浓度响应曲线证明实验重复性良好。
结果表明添加 CXCL-12（3-200 nM），人类 T 淋巴细胞会产生明显的浓度和时间依赖性趋化作用；浓度越高引起的运动就越快，所测得的 EC50 为 23 nM。对照组或非活性趋化因子 CXCL-11（100 nM）未产生定向迁移。添加 CXCR-4 受体拮抗剂 AMD3100 可消除对 CXCL-12 的响应。对人源 Jurkat T 细胞进行了类似的观察。在四个平行的分析板中，对照组的 Z'值范围在 0.5～0.8 之间，CXCL-12 EC50 值范围在 19～33 nM 之间，这表明该分析的精度和重复性极高。
iQue® 高通量流式应用
图 5. iQue® 高通量流式测试 T 细胞活性原理及流程。
案例 3. 细胞疗法应用
来自赫尔辛基大学的学者发现了能增强 CAR-T 作用的小分子，并发现了新的肿瘤细胞杀伤机制，并发表在血液病学的顶级杂志《BLOOD》上[1]。研究的主要技术路线为：
● 1. 加入效应 T 细胞和小分子库筛选观察小分子对一种表达荧光素的初级 B 细胞系杀伤的增强或者抑制作用（荧光素酶法），并检测这些小分子对 TCR 相关信号通路激活相关因子表达的影响（流式细胞法）。
● 2. 同路线 1，将一种肿瘤细胞替换成不同的表达荧光素的初级 B 细胞系，检测筛选出的小分子对不同细胞系的 CART 杀伤活性抑制或者增强。
● 3. 检测筛选出的小分子对白血病病人中的初级 B 细胞系的 CAR-T 杀伤的增强作用（流式细胞法）。
● 4. 用 CRISPR 基因编辑研究影响癌细胞对 CAR-T 细胞的敏感性的机制。
其中 iQue® 高通量流式细胞仪是这篇文章的主要技术手段之一，被应用于路线的 1 和 3 中。
案例 4. 抗体药物应用
墨西哥国立理工学院研究人员验证了一项使用传统流式细胞术测试生物制药产品的功效和效力的 ADCC 分析[2]。基于他们在 GLP-cGMP 环境中开发和验证生物测定的经验，他们将该 ADCC 测定转移到高通量 iQue® 平台上，实现了在同一个样品中同时评估细胞膜通透性、Caspase 活性以及磷脂酰丝氨酸暴露，并作为目标细胞死亡的特征。这些结果表明，高通量技术适合用在质量受控的环境中，其自动化流程便于以更快的速度完成数据采集和分析，并获得精确的结果。
通过系统性传输双特异性「桥接」蛋白来招募天然 T 细胞已成为抗击癌症的一种重要方式。这些分子通常包括肿瘤靶向基团，其可与抗 CD3 识别区域融合，从而与 T 细胞结合。这种方法使 T 细胞能够接近肿瘤细胞，从而触发靶细胞裂解。路德维希癌症研究所科研人员研究了肿瘤内皮标记物（TEM 1）作为 T 细胞重定向免疫治疗靶点的潜力。TEM 1 是一种在肿瘤中频繁表达的细胞表面抗原，其与传统的双特异性抗体模式相比，能够提高靶标选择性。研究人员使用 iQue® 平台对这些新型三价 T 细胞接合子产生的效应子细胞因子进行了定量[3]。
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内容审核：刘果
法务审核：邱天天
图片来源：赛多利斯
参考文献：
[1]. Olli Dufva et al. Integrated drug profiling and CRISPR screening identify essential pathways for CAR T cell cytotoxicity. 2020; 27;135(9):597-609.
[2]. Camacho-Sandoval R, Jimenez-Uribe A, Tenorio-Calvo AV, et al. Taking advantage of a high-throughput flow cytometer for the implementation of an ADCC assay for regulatory compliance. Biotechnol Rep. 2020; 26:e00456.
[3]. Fierle JK, Brioschi M, de Tiani M, et al. Soluble trivalent engagers redirect cytolytic T cell activity toward tumor endothelial marker 1. Cell Rep Med. 2021;2(8):100362.
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