Western blot 方法在 SCI 文章中出现的频率非常高，漂亮的 WB 电泳图可以给文章增色不少。但是 WB 实验的步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花费很多时间和精力去摸索实验技巧的。
接下来，小编将结合自己的经验以及网上可以搜索到的 WB 实验技巧，为大家介绍一下 WB 实验过程中的关键点。虽然 WB 实验步骤很多，但只要抓中其中的几个重点方面，就可以得到干净、漂亮、清晰、客观的电泳图。
一、 样品准备部分
小编认为，我们不应该太过重视 WB 电泳部分的操作技巧，样品准备才是整个 WB 实验中最重要的一个环节（没有之一）。否则 WB 电泳技术再高也无法得到好的结果。小编认为以下 3 点值得大家重点关注：
1. 注意孵育、终止时间
如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。
2. 抑制蛋白降解
这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：
(1) 使用蛋白酶抑制剂
小编使用的是罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂，效果不错。再与 PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。
(2) 全程低温操作
提前预冷 PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。小编除了使用冰盒，大多数操作都是在 4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。
3. 裂解液用量
将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。
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⬇️⬇️⬇️WB 过程中常见问题及建议大汇总
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