武汉病毒治疗策略综述

2020-02-03 12:32 来源:丁香园 作者:美国霍普金斯医院病理科医师 Robert L. Kruse M.D., Ph.D.
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作者:Robert L. Kruse M.D., Ph.D.美国霍普金斯医院病理科医师,乙肝病毒研究专家。

翻译: 黄宇婷 M.D., Ph.D.美国马里兰大学医学中心医师,美国霍普金斯医院博士后

致谢: 马怡娴 M.D.中国科学院上海药物研究所

摘要

起源于中国武汉的新型冠状病毒 (2019-nCoV) 造成呼吸道病毒大流行并对世界人又构成威胁。当前的工作集中在对感染者的限制和隔离。最终可以通过保护性疫苗来控制 2019-nCoV 感染。目前帮助患者并避免潜在死亡的需求十分迫切,尽管已经大力开展疫苗研究, 然而目前尚无治疗 2019-nCoV 感染的方法。在此,我回顾了治疗患者 2019-nCoV 的潜在策略,重点强调了在这种暴发中开发新的有效疗法的速度和及时性的必要性。我考虑了调整现有药物用途、中和性单克隆抗体疗法以及针对病毒 RNA 基因组的寡核苷酸等策略,并对比了这些方法的前景和不足。最后,我提出一种最快的治疗方法,该方法可以抵抗病毒将来可能发生的任何突变。该方法是合成一种将可溶形式的病毒受体血管紧张素转化酶 2(ACE2) 与免疫球蛋白 Fc 结构域融合的融合蛋白,可通过阻止 2019-nCoV 进入宿主细胞从而最大限度避免病毒逃逸,同时还有助于募集免疫系统以建立持久的免疫力。本文将公布ACE2-Fc 融合蛋白的氨基酸序列,希望研究人员应用重组蛋白表达系统快速生产新

药用来治疗患者,随后进行正式的临床试验。这种治疗方法可以广泛使用帮助感染

患者度过等待保护性疫苗研发所需的几个月甚至几年。

关键词 

冠状病毒,武汉,中和抗体,血管紧张素转化酶 2,爆发,2019-nCoV

引言

2019 年 12 月,中国武汉市发生了一种引起肺炎的神秘疾病,这些肺炎病例的最终特征是由新型冠状病毒 (2019-nCoV)1 引起,如今这种疾病正在发展成潜在的大流行病。冠状病毒引起疾病爆发并非首次,其中包括重症急性呼吸综合征 (SARS)2 和中东呼吸综合征 (MERS)3。最初被识别出时,SARS 和 MERS 引起了爆发担忧。SARS 在蔓延到其他国家之前,在香港和中国南方造成了重大经济损失。根据世界卫生组织 (WHO)4 的数据,SARS 最终感染了 8098 人,造成 774 人死亡。

起源于武汉的新型冠状病毒 2019-nCoV 在世界范围内迅速传播。家族病例报告 5 已经证实了 2019-nCoV 的人际传播,同时在中国和世界其他国家和地区仍在继续发现其他病例。 2019-nCoV 感染的临床症状包括 发烧、咳嗽、肌痛、乏力,胸部 CT显示肺炎 6。在中国,武汉市和其他几个城市都已经关闭,不允许人员离开武汉以遏制该病毒扩散; 在这样规模的城市中,这种努力在很大程度上是前所未有的(https://www.nytimes.com/2020/01/22/world/asia/coronavirus-quarantines-history.html)。目前,正在对许多旅行者进行体温 (≥ 38°C) 筛查,并报告他们最近到武汉旅行的历史,以便指导诊断测试 7。

这些措施不仅曾经发生于 2002-2003 年 SARS,也曾发生于 2014-2015 年埃博拉病毒爆发。在这些暴发期间,都曾经对感染者和确定有风险的患者接触者进行隔离 8。

医护人员是易感人群,尽管采取了广泛的个人防护设备措施,但临床工作者的确在两次疫情中均受到感染 9。爆发期间,除支持治疗措施之外没有针对 SARS 或埃博拉病毒的特异性抗病毒治疗 10,11,这与 2019-nCoV 面临的现状很相似。

疾病爆发情况下患者所面临的严峻形势要求医疗界和生物技术行业做出快速反应。不幸的是,很多传统药物研发方法往往需要几个月甚至几年时间,不足以快速应对爆发性疾病,造成人员死亡和经济停滞不前。 在这种情况下,实验性研究往往得以加速并快速获得临床试验的批准。最近在 2014-2015 年埃博拉疫情中,各种临床试验候选物均进行了研究。尽管这些治疗中许多都失败了,但最终确实研制出了一种可以完全抵抗病毒的疫苗 12。然而值得强调的是,与当前 2019-nCoV 的情况不同,埃博拉病毒已经被研究了多年,并且这种中和疫苗在疫情爆发前几年就已经在临床前动物模型中生产和实验 13。对于 2019-nCoV,除了冠状病毒的棘突蛋白 (S) 的序列 (GenBank:MN908947.3) 外,尚无关于这种特殊蛋白如何具有免疫原性的研究,无法与 SARS 和 MERS 进行替代比较,这也降低了快速生产疫苗的可能。此外,尽管疫苗在阻止 2019-nCoV 传播方面将非常有效,已感染 2019-nCoV 的患者也需要有效的治疗方法,类似于埃博拉病毒患者在疫苗接种期间需要有效治疗的情况。

本文将概述可用于治疗 2019-nCoV 病毒的不同潜在治疗方案,在对 2019-nCoV 研究有限的情况下,将重点放在可以在患者中快速测试且广泛应用的药物研发上。简而言之,在基础实验室中进行 2019-nCoV 研究的时间有限,已感染的患者急需有效的治疗疗法。我最终提出我认为最佳的可行方案,以及有关如何制造这种融合蛋白用以快速应用于患者治疗 。

抗 2019-nCoV 治疗方法综述研制抗 2019-nCoV 中和抗体

冠状病毒进入细胞始于 S 蛋白与细胞表面靶受体的结合,在细胞膜融合后将病毒核衣壳传递到细胞内以进行复制 14。 S 蛋白以引起感染细胞与周围其他带有同样受体的细胞形成合胞体而闻名,S 蛋白在病毒体状态下不起作用。

以 2019-nCoV 表面的 S 蛋白为目标的中和抗体可能是学术和工业生物医学研究人员预想的第一种疗法,对疾病产生被动免疫 15。最近公布的 2019-nCoV 基因组序列(GenBank:MN908947.3) 使研究人员可以在实验室中进行基因合成,并考虑将 S蛋白表达为免疫原。传统的筛选小鼠或兔中和抗体的方法对于此次暴发来说可能太慢,但是更快的方法,例如使用表达抗体片段的噬菌体或酵母表达文库,可以快速用于鉴定病毒中和的主要候选物 16,17。挑战在于,任何候选抗体都需要在细胞培养和动物模型中进行严格测试,以确认其能够中和 2019-nCoV 并防止感染。此外,需要测试在人群中传播的几个分离株,以评估中和抗体的覆盖范围是否足够大。来自其他冠状病毒种类 (如 SARS) 的信息将有助于确定最佳抗原决定簇的位置,以产生中和抗体 (S 蛋白中的受体结合域是一个关键目标)18,但这也是一个缓慢而具有挑战性的过程,几个月内可能不会产生显著的成效。此外,最终可能需要混合抗体来确保对患者的充分保护,这将增加配方和制造的复杂性。像以下讨论的一些治疗方案一样,在低等生物 (细菌、酵母、昆虫细胞) 中表达任何主要表达候选物的能力将有助于加快产生对患者的治疗药物 19。

产生针对 2019-nCoV S 蛋白的中和抗体的另一种策略是用 2019-nCoV S 蛋白免疫大型动物 (绵羊、山羊、牛),然后从动物中纯化多克隆抗体 20。这一策略可以在爆发的情况下提供快速服务,并且具有许多优点,例如简化生产和制造,但是不能保证每只动物产生中和抗血清或每只动物的抗体滴度 21。此外,人类对其他物种的外来免疫球蛋白也有免疫反应,这可能使各种治疗方案复杂化 22。在真正的绝境下,这种策略在短期内可能是可行的,但在 2019-nCoV 疫情中不容易扩大规模,因为该疫情已经迅速蔓延。

使用针对 2019-nCoV RNA 基因组的寡核苷酸

除了靶向 2019-nCoV 的表面蛋白,还可以靶向 RNA 基因组本身使其降解。最近发布了 2019-nCoV 的 RNA 基因组序列 (GenBank:MN908947.3),当时可以考虑的一个策略是使用小干扰 RNA(siRNA) 或反义寡核苷酸 (ASO) 通过靶向其 RNA 基因组来对抗病毒 23。这一策略面临多重挑战。首先,CoV2019 的保守 RNA 序列域未知。鉴定保守序列对于优化 siRNA 靶向和避免寡核苷酸策略的病毒逃逸至关重要。可以通过观察 2019-nCoV 与 SARS 病毒的基因组同源性来比较保守序列,但这仍然是猜测。第二个挑战是如何输送寡核苷酸到肺部。递送载体如脂质纳米粒已经取得进展,其可以介导递送至肺部 24。然而,尚不清楚是否有足够的 siRNA 或 ASO 被有效递送至肺部,从而阻止感染或改变其临床进程。例如,如果肺中 25% 的肺泡上皮细胞含有siRNA 或 ASO,这种效率对于传统的基因治疗可能是一个巨大的成功,但是对于病毒感染几乎没有任何影响。尽管临床前动物模型取得了显著成功 26,27,但这种解释也很可能是抗埃博拉的 siRNA 候选药物在试验中 25 失败的原因。最后,即使假设siRNA 在临床上有效,将 siRNA 药物的生产扩大到大量受感染人群的能力也有限。目前的 siRNA 和 ASO 疗法是为罕见疾病制造的,且没有可用的资源来快速制造这些药物。

重新利用目前可用的抗病毒药物 

对抗 2019-nCoV 的理想药物是获批的小分子药物,它们可以抑制病毒生命周期的不同阶段,最终抑制其复制。两类潜在目标是病毒聚合酶 28 和蛋白酶抑制剂 29,它们都是人类免疫缺陷病毒 (HIV) 和丙型肝炎病毒 (HCV) 抗病毒方案的组成部分。绝望的临床医生已经用各种重新利用的抗病毒药物进行了试验性临床研究。除了病例报告之外,以前的每一次病毒爆发都是如此,但收效甚微 30。事实上,在埃博拉爆发期间,没有一种重新利用的小分子药物被明确证明能改善所有患者的临床病程 31。2019-nCoV 可能有所不同,有初步的阳性报告表明,作为 HIV 蛋白酶抑制剂的洛皮纳韦和利托纳韦对 2019-nCoV 具有一定的临床疗效,类似于之前用于抗 SARS的研究 32。应继续开展研究,在 2019-nCoV 细胞培养模型中筛选其他临床可用的抗病毒药物,希望出现一种对该病毒有用的候选药物,并能在临床上迅速应用。一个有希望的例子是 remdesivir,它能干扰病毒聚合酶,并在小鼠模型中显示出对 MERS的疗效 33。如需更多信息,请查阅以往针对冠状病毒的药物再利用工作 34,35。尽管

这些重新利用的药物可能有希望,但仍然有理由寻求新的 2019-nCoV 特异性疗法来补充潜在的重新利用的候选药物。

从恢复期患者血清中提取抗体进行被动免疫 

一个简单但可能非常有效的可用于传染性疫情的工具,是使用从病毒感染中恢复的患者血清来治疗之后感染病毒的患者 36。病毒感染得到解决的患者将对 2019 年的不同病毒抗原产生多克隆抗体免疫应答。从病毒感染中恢复的患者将对 2019-nCoV 的不同病毒抗原产生多克隆抗体免疫应答。这些多克隆抗体中的一些可能会中和病毒并防止新一轮感染,已从病毒感染中恢复的患者应产生高滴度的 2019-nCoV 抗体。

2019-nCoV 已恢复的患者只需捐献血浆,然后将血浆输入感染患者体内 37。鉴于血浆捐献是成熟的方法,并且血浆输注也是常规医疗护理,该建议不需要任何新的科学或医学批准即可实施。事实上,在 2014-2015 年埃博拉爆发期间,用相同的原理,即使用恢复期血清治疗了几名埃博拉患者,其中包括两名感染的美国医护人员 38。

随着疫情的继续,将有更多幸存的患者成为 2019-nCoV 抗血清的捐献者,并且可以开发出大量抗血清用于治疗病情最严重的患者。不幸的是,疫情的指数级增长将与这一策略背道而驰,因为病例数量的增长可能超过先前患者提供供体血浆作为治疗的能力。此外,康复患者血清在抗病毒作用的效力上会有显著的变异性,使其不太理想 37。虽然输血医疗服务现在当然应该将康复期患者血清作为患者治疗的一种选择,但最终在控制疫情的有效范围上受到限制。

关于新 2019-nCoV 治疗方法的建议

在爆发期间对抗 2019-nCoV 的最简单最直接的方法是中和病毒进入细胞的功能, 也是抗体通常在体内发挥的作用 39。然而 很难快速验证广泛的中和抗体,并且要从恢复期患者血清中提取抗体进行被动免疫 

确保突变的 RNA 病毒不会逃逸抗体的中和作用。鸡尾酒抗体方法曾经在治疗埃博拉大流行 40 中使用,但会增加制造过程的复杂性。

另一种策略不直接针对病毒糖蛋白作为靶点,而是针对细胞膜表面的病毒受体蛋白作为靶点发挥中和作用,从而阻止病毒与其结合并进入细胞。幸运的是,科学家们已经在细胞培养中发现了病毒受体。最近的研究发现,2019-nCoV 使用血管紧张素转化酶 2(ACE2) 作为细胞进入的受体 41,这与 SARS 冠状病毒用于进入的受体相同 42。这两种冠状病毒都通过病毒体上的 S 蛋白与 ACE2 结合,病毒膜和细胞膜融合,随后 RNA 病毒将在细胞内复制其基因组并最终产生新的病毒颗粒,这些病毒颗粒将被分泌以感染其他细胞。 SARS 和 2019-nCoV 都使用 ACE2 受体这一巧合使将 SARS 进入细胞机制相关研究成果应用于 2019-nCoV 成为可能。根据 SARS 相关文献,有以下几种策略在防止 SARS 模型中能够有效预防感染。

结合 ACE2 受体的阻断剂

第一种策略是给患者服用一种能与 ACE2 结合的药物。这里的关键优势是宿主ACE2 蛋白不会改变,因此不需要担心与药物的结合会脱靶。此外,在此次疫情爆发的时间范围内,病毒将无法突变和结合全新的宿主受体; 这种功能关系是通过长期进化建立的。类似地,流感病毒每年都会改变其表面的突变以逃避抗体中和,但它总是使用细胞表面的唾液酸作为受体进入细胞 43。

阻断剂结合到 ACE2 有两个已知选项。第一种方法是使用 SARS 病毒 S 蛋白的小受体结合域 (RBD),该结合域已被证明是进入细胞过程中结合 ACE2 受体的关键域 44。使用该结合域 (大小为 193 个氨基酸) 已被证明能有效阻止 SARS 进入细胞培
养 44。传染性 SARS RBD 可以给病人服用,从而使他们的 ACE2 蛋白与靶细胞结合,防止感染,这是完全合理的 (图 1)。此外,也有可能生产出 2019-nCoV 的等效RBD,并用作治疗手段。该策略假设 SARS 和 2019-nCoV 在 ACE2 上具有相同的结合位点,鉴于 SARS 和 NL63 冠状病毒具有相似的 ACE2 结合位点,这种可能性很大。这种分子很小 (类似于驼类抗体的纳米体的大小) 将增强生物向组织的灌注,

以更有效地结合病毒使用的受体 45。就正在发生的疫情而言,这种小蛋白质可在细菌蛋白表达系统中快速产生,这将有助于提高产量 19。此外,中国已经有很多药厂拥有细菌蛋白表达系统,将允许 RBD 蛋白快速投入生产 46。或者也可以将 RBD 蛋白连接到一个 Fc 片段上,用于延长半衰期,在 MERS 相关研究中曾合成这个 212个氨基酸的结构域。MERS RBD-Fc 融合体证明了阻断病毒对细胞受体感染的能力,以及刺激小鼠对该特定病毒域的免疫反应的能力 47。值得注意的是,由于 RBD-Fc融合体将与正常细胞结合,人们希望通过突变来消除 Fc 受体结合造成的细胞毒性

Fc 结构域功能 48。

第二个类似的策略是使用一种能结合 ACE2 蛋白的抗体,从而防止 2019-nCoV 感染(图 1)。实验表明,该策略能有效阻止 SARS 的进入和复制 42。虽然文献索引中没有公布 ACE2 抗体序列,但单克隆抗体确实存在,相关杂交瘤序列可以在几天内克隆。使用这种策略不需要担心 ACE2 结合抗体的任何病毒逃逸,这是相比于针对S 蛋白的中和方法的优势。在考虑如何使用 ACE2 抗体策略时应注意以下问题。 应该去除 Fc 结构域 49 的功能,这样就不会在表达 ACE2 的正常组织中引起炎症。这将保持 Fc 结构域赋予的长半衰期而没有任何副作用。包含 Fc 结构域的缺点是需要使用更昂贵的哺乳动物细胞生产系统来保持适当的糖基化,这在疫情爆发情况下会延长将药物供给患者的生产时间。或者可以只使用一个结合 ACE2 的单链可变片段(scFv)。驼类抗体的纳米体或 VHH 域也是另一种选择 50,51。其结构很小可以在细菌中生产, 可以快速渗透到不同的组织,缺点是没有 Fc 结构域的这些分子半衰期较短。

这两个选项的应用有几个限制。关于 SARS RBD 策略,人体最终可能会对 SARS 蛋白产生免疫反应,尽管抗击 2019-nCoV 的关键感染干预期可能等不及这些免疫反应的发生,但在这一时间窗之后将对两种冠状病毒都产生免疫反应。或者,如果使用 2019-nCoV 的同源 RBD 本身,这种免疫反应可能是非常有利的,因为它可以同时产生阻断效应和疫苗接种效应 52。对于这两种策略,阻断体内不同器官的 ACE2

受体所需的剂量是未知的,为了减缓感染需要饱和的 ACE2 受体的百分比也是未知的。体内 ACE2 受体的数量最终可能会阻碍这一策略。此外,细胞表面 ACE2 受体的代谢更新也将影响治疗蛋白需要给药的频率。为了解决这个问题,可以通过雾化对肺部进行局部给药,在肺部感染的关键部位增加抗 ACE2 治疗的浓度。最终,患者的临床试验需要明确这些潜在的问题。

免疫粘附蛋白 ACE2-Fc 策略

该策略旨在合成一种与冠状病毒本身结合的抗体样分子,而不是保护细胞不被感染。对于此策略,建议使用可溶形式的 ACE2 受体,该受体可与 2019-nCoV 的 S 蛋白结合,从而中和病毒 (图 1)。同样,对 SARS 病毒的研究表明,这种策略具有潜在的前景。可溶性 ACE2 受体被证明可以阻止 SARS 病毒感染体外培养的细胞 42。可溶性 ACE2 与 SARS S 蛋白的亲和力为 1.70 nM,与单克隆抗体的亲和力相当 53。2019-nCoV 对 ACE2 的亲和力可能相似。为了将 ACE2 用作治疗患者的治疗方法,建议将可溶性 ACE2 转化为与免疫球蛋白 Fc 结构域融合的免疫粘附蛋白形式,从而延长循环分子的寿命,同时还招募免疫系统攻击病毒。尽管未在动物模型中进行测试,但前期研究表明与人 IgG1 域融合的 ACE2 细胞外域 (ACE2-NN-Ig) 在体外有效中和 SARS 冠状病毒,抑制浓度为 2 nM54,抑制率为 50%。这项研究也提供了证据证明 ACE2-Fc 可以在体外实验中抑制 2019-nCoV,并有望在患者中同样有效 。

具体地说,ACE2 蛋白的细胞外结构域将合成到人免疫球蛋白 G 的 Fc 结构域上
(图 2A)。研究表明,ACE2 氨基酸 19 – 615 足以与 SARS S 蛋白结合 55,尽管使用更小的细胞外结构域也有可能已经足够了。这将小于以前开发的免疫粘附蛋白 54。进一步的研究可以关注使用更小的 ACE2 结构域就足以结合 2019-nCoV 的 S 蛋白,从而构建更小的 ACE2-Fc 蛋白。虽然我们尚不知道 2019-nCoV S 蛋白的结构或其
与 ACE2 受体的结合方式,但现在可以合理地假设 SARS 病毒利用的 ACE2 蛋白结构域同样的也被 2019-nCoV 结合从而感染细胞。

Fc 结构域的优势是延长了药物的半衰期,这可以使医护人员在见到感染患者之前可以预防性地给予药物剂量,达到预防感染的目的。与先前的阻断剂策略的不同之

处在于,Fc 结构域功能尚存,从而允许通过 CD16 激活树突状细胞,巨噬细胞和自然杀伤细胞来抵抗病毒颗粒感染细胞。这可能有助于更快地激活宿主抗病毒免疫反应并消除病毒,这在 SARS 小鼠模型中得到了证明,与仅中和病毒的抗体相比,与 Fc 结合的抗体通过吞噬细胞的激活在消除 SARS 方面更为有效 56。总体而言,ACE2-Fc 融合蛋白将具有与传统中和抗体相同的许多好处,可以寻求作为治疗感染的手段,但是由于相同的蛋白质 ACE2 也是病毒进入细胞的受体,2019-nCoV 无法逃避其中和作用,因此它具有最大的广度和效力。

为了进一步支持受体-免疫粘附蛋白作为潜在抗病毒策略的潜力,值得一提的是CD4-Fc 或 CD4-IgG 是发展为潜在 HIV 药物的早期药物之一 57。该蛋白质包含 CD4受体的前两个结构域,已知与感染的 HIV 细胞表面上的 gp120 结合。已显示 CD4-IgG 可在体外中和 HIV 防止感染。尽管只有有限的临床获益,但该蛋白质在患者中给药仍是安全的 58,59。已开发出更新的 CD4-IgG 增强版本 具有衍生共受体CCR5 的小肽,可增强亲和力并提供更有效的中和活性,基本上可分离 100% 的HIV,并使猕猴对多次猿猴抗性-人免疫缺陷病毒感染具有免疫力 60,61。虽然 HIV和 2019-nCoV 是非常不同的病毒,具有不同的细胞类型,动力学和临床过程,但先前的 HIV 结果令人鼓舞,这可能是 2019-nCoV 的有效治疗策略。 2019-nCoV 可能更适合这种中和疗法,因为与 HIV 不同,HIV 会在具有不同宿主细胞中引起慢性感染,而呼吸道病毒引起的是急性感染。

ACE2-Fc 策略的一个潜在局限性是细胞外 ACE2 水平的增加可能对人体产生未知的影响。人体组织已经分泌了少量的细胞外 ACE2,因此该细胞外结构域进入血液循环并是前所未有的 62。 SARS 病毒与 ACE255 的肽酶结构域结合,可以预见将肽酶活性相关的关键氨基酸进行突变可以废除该序列的天然功能,同时保持对 SARS 和2019-nCoV 的高亲和力。前期研究已经在生成 ACE2 和 IgG1 融合蛋白中尝试了这种可能性,该蛋白表明 ACE2 细胞外域的 374 和 378 位的组氨酸残基突变消除了肽酶活性,但保留了与 SARS 的 S 蛋白 54 的高亲和力结合。因此建议在将来治疗2019-nCoV 患者时寻求一个突变的 ACE2 结构域,以避免任何副作用 (图 2B)。另一个潜在的担忧是,通过抗体形式的受体结合可能会无意中将 2019-nCoV 导向

感染 Fc 受体 (CD16) 阳性细胞,这已在 MERS32 中和抗体的体外实验中被报道 63。目前尚不清楚这将具有什么临床意义,以及在体内将在多大程度上发生。最终,仍需要临床试验来发现 ACE2-Fc 治疗的任何特定副作用。

应对行动方案及讨论

针对 2019-nCoV 的全球卫生工作的主要目标仍然是有效隔离患者并筛查可能被感染者以限制传播。该目标应继续。此处建议的是一种选择至少可以快速给受感染的患者用药,以帮助缓解症状和预防死亡,与此同时为 2019-nCoV 疫苗研制工作争取时间。被动免疫也可以为处于危险中的医疗工作工作者提供防护。本文作者建议中国和其他地区的医生、科学家和生物技术行业立即寻求制造 ACE2-Fc 生物制剂并进行试验。各种不同的蛋白质表达平台 (CHO,昆虫,酵母) 都可以表达该蛋白,各机构可以根据自己的实际情况、专业知识和技术特长加以选择 。甚至可以考虑使用基因疗法从 DNA 或 mRNA 水平合成 ACE2-Fc,但存在不确定的基因治疗相关的额外风险,最终可能减慢治疗患者的进程。

当前目标是 ACE2-Fc 可以治疗已被感染的患者从而预防严重的发病和死亡,同时还可以作为潜在的预防手段,对一线临床医生以及可能接触该病毒的疑似患者提供被动免疫。ACE2-Fc 可能是当今全球卫生界与 2019-nCoV 对抗所需的有效中和抗体。与使用恢复期患者血清相比,由于后者以来恢复期患者的捐赠,生产融合抗体可以更快的达到规模性生产。ACE2-Fc 也对病毒突变从而逃逸中和反应具有抵抗力,与可能在未来几周至几个月内将被报道的中和性单克隆抗体不同。

虽然此处概述了短期治疗策略,但 2019-nCoV 研究的长期目标仍将是开发有效的疫苗,使人体免疫以产生中和抗体,可能基于 S 蛋白,尤其是 RBD 蛋白。这样的试验应尽快进行,但可能难以获得足够的免疫原性、抗原呈递和有效的抗体刺激。该病毒还可能会继续变异从而继续逃逸宿主已经产生的保护性免疫。相比之下,2019-nCoV 无法摆脱 ACE2-Fc 的治疗策略,因为它利用自身的同源受体进行感染,如果这个部分发生了突变,病毒将不能结合人体细胞。最后,根据载体形式 (例如

病毒载体,mRNA,蛋白质) 如何确定有效的疫苗剂量也很重要,甚至是完全保护性的疫苗也不能帮助目前感染该病毒的患者。

为了帮助中国的研究人员和制药行业抗击 2019-nCoV,作者提供了 ACE2-Fc 的蛋白质氨基酸序列 (图 2B)。可以考虑使用不同的人 Fc 结构域 (IgG1,IgG2,IgG3 或 IgG4),尽管 IgG1 通常具有触发抗微生物反应的最大能力 33。考虑到该序列的基因合成可以在一周内完成,因此可以在不久后将该基因在所选的蛋白质表达平台内进行表达从而快速产生蛋白质。现有制药业常用的蛋白质 A 柱和其他纯化抗体技术的可利用中国现有的抗体生产力迅速生产 ACE2-Fc 。

追求 ACE2-Fc 的最终好处是,它可以有效地用作治疗 SARS 和 2019-nCoV 未来病毒爆发的药物库存,也可以应对任何将来使用 ACE2 受体进入细胞的人畜共患病新冠状病毒。此外,也可以研究在中国和其他国家的动物中复制的冠状病毒以评估其进入细胞的机制。通过了解冠状病毒进入其他动物细胞的机制可以有效地预测可用于任何人畜共患病传播的受体并构建一种新的受体免疫粘附素蛋白。例如,MERS使用 DPP4 作为该病毒使用的受体,可以设想类似的免疫粘附素 DPP4-Fc 将对MERS 爆发有用。除冠状病毒外,该策略还可以用于存在高爆发风险的其他病毒。

综上所述,ACE2-Fc 有望成为当今医护人员治疗和预防 2019-nCoV 感染所需的中和抗体,并且如果基于氨基酸序列药物生产可以很快开始,那么 ACE2-Fc 可能在疾病爆发中发挥重要作用。如果想在一个抗体分子中实现,也可以寻求另一种2019-nCoV RBD-Fc 融合体。

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图 1. 可用于阻止 2019-nCoV 感染细胞的治疗剂。表达 ACE2 的靶细胞包括人体内的肺和胃肠组织。冠状病毒表面的 S 蛋白与受感染细胞上的 ACE2 结合,使其进入细胞。三种提及的策略将阻止这种相互作用,从而消除感染。首先,将使用来自SARS 或 2019-nCoV 的 S 蛋白的受体结合结构域 (RBD),从而结合 ACE2 并饱和可用位点。或者,可以针对 ACE2 使用抗体或单链抗体片段 (scFv) 来实现相同的目的。第三种策略是通过利用 ACE2 胞外结构域作为诱饵与突刺蛋白结合,直接靶向冠状病毒的病毒体。融合到 ACE2 的 Fc 结构域 (ACE2-Fc) 从而获得长的半衰期。

企业微信截图_d1c955ad-1b64-4aa7-809a-e2519413ad5f.png图 2.,作为治疗 2019-nCoV 冠状病毒的 ACE2-Fc 融合蛋白的设计。 (A) ACE2 的胞外结构域被附加到人免疫球蛋白 Fc 结构域上,包括铰链区。Fc 结构域促进两个ACE2 结构域的二聚化。 (B) 提供了 ACE2-Fc 融合蛋白的氨基酸序列。ACE2 结构域由人类 ACE2 蛋白的氨基酸 18-615 组成 (蓝色;UniProtKB - Q9BYF1),残基
374 和 378 发生突变,用天冬酰胺 (黑色 N) 取代组氨酸 (H),以消除肽酶活性。提供了人免疫球蛋白 G 同型 1 恒定区的序列 (绿色;UniProtKB - P01857)。提供了来自人免疫球蛋白重链的分泌信号 (红色;UniProtKB - A0A0C4DH39)。


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编辑: 黄建琴

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