高手进阶:细胞培养最常遇到的问题都在这了

2016-12-28 10:39 来源:生物学霸 作者:丁香园站友
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本文经授权转自公众号:生物学霸(微信号:ShengWuXueBa)

养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待,爱护她,呵护她。上篇提到细胞培养的注意事项,反响热烈,这次就来讲讲细胞培养常见问题的原因及对策。

1. 培养液 pH 值变化太快

原因:

CO2  张力不对

培养瓶盖拧得太紧

NaHCO3  缓冲系统缓冲力不足

培养液中盐浓度不正确

细菌、酵母或真菌污染

对策:

按培养液中 NaHCO3  浓度增加或减少培养箱内 CO2  浓度,2.0 g/L 到 3.7 g/L 浓度 NaHCO3  对应 CO2  浓度为 5% 到 10%。或者改用不依赖 CO2  培养液

松开瓶盖 1/4 圈

加 HEPES 缓冲液至 10 到 25 mM 终浓度

在 CO2  培养环境中改用基于 Earle’s 盐配制的培养液,在大气培养环境中培养改用 Hank’s 盐配制的培养液

丢弃培养物或用抗生素除菌

2. 培养液出现沉淀,pH 值不变

原因:

用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来

冰冻保存培养液

对策:

用去离子水反复冲洗玻璃器皿,然后除菌

将培养液加热到 37 ℃,摇动使其溶解如沉淀仍然存在,丢弃培养液

3. 培养液出现沉淀,同时 pH 发生变化

原因:

细菌或真菌污染

对策:

丢弃培养物或用抗生素除菌

4. 培养细胞不贴壁

原因:

胰蛋白酶消化过度

支原体污染

培养液中无贴壁因子

对策:

缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度

分离培养物,检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染,丢弃培养物

改变培养液成分

5. 悬浮细胞成簇

原因:

培养液中含钙、镁离子

支原体污染

蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放 DNA

对策:

用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞,轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液

分离培养物,检测支原体。如发现支原体污染,丢弃培养物

用 DNase I 处理细胞

6. 原代细胞培养物污染

原因:

原代培养组织在进入培养前已污染

对策:

培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织

7. 培养细胞死亡

原因:

培养箱内无 CO2

培养箱内温度波动太大

细胞冻存或复苏过程中损伤

培养液渗透压不正确

培养液种有毒代谢产物堆积

对策:

检测培养箱内 CO2

检查培养箱内温度

取新的保存细胞种

检测培养液渗透压。注意:大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为 260~350 mOsm/kg。加入额外试剂如 HEPES 或药物都有可能影响培养液渗透压。

换入新鲜培养液

8. 培养细胞生长减慢

原因:

由于更换不同培养液或血清

培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏

培养物中有少量细菌或真菌污染

试剂保存不当

接种细胞起始浓度太低,细胞已老化

支原体污染

对策:

比较新培养液与原培养液成分,比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液

换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子

用无抗生素培养液培养,如发现污染,丢弃培养物。或用抗生素除菌

血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培养液需在 2~8 ℃ 避光保存。含血清完全培养液在 2~8 ℃ 保存,并在 2 周内用完

增加接种细胞起始浓度,换用新的保种细胞

分离培养物,检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染,丢弃培养物 

9. 保存血清最好的方法?

建议血清应保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而,若存放于 4 ℃ 时,请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。

10. 如何解冻血清不会使其质量受损?

建议将血清从冷冻箱取出后,先置于 2~8 ℃ 冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。

11. 血清解冻后有絮状沉淀物怎么办?

血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。

但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以 400 g 稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞您的过滤膜。

12. 为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养 ES 细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

13. 有必要做热灭活吗?

实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。

而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是「小黑点」,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在 37 ℃ 环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

14. 储存冰箱中的胎牛血清出现沉淀?

GIBICO 的胎牛血清没有预老化,储存在 2~8 ℃ 时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在 -20 ℃ 储存胎牛血清,避免反复冻融。

15. 如何避免沉淀物的产生?

解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20 ℃ 至 4 ℃ 至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如 -20 ℃ 至 37 ℃),实验显示非常容易产生沉淀物。

解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

请勿将血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活,请遵守 56 ℃,30 分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

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编辑: 冯宁

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