细胞养不好?这些注意事项请收好

2016-12-21 12:17 来源:生物学霸 作者:丁香园站友
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养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待,爱护她,呵护她。如果你照顾的时候能注意这些问题,会让你的细胞养的更好。下面就将养细胞的注意事项跟大家交流一下。

1. 冷冻管应如何解冻? 

取出冷冻管后,须立即放入 37 ℃ 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管的爆裂。

2. 细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除 DMSO?

除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。

4. 可否使用与原先培养条件不同的血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5. 何谓 FBS,FCS,CS,HS?

FBS(fetal bovine serum)和 FCS(fetal calf serum)是相同的意思,两者都是指胎牛血清, FCS 是错误的使用字眼,请不要再使用。CS(calf serum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。

6. 培养细胞时应使用 5% 或 10% CO2?或根本没有影响?

一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统,而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时,细胞培养时应使用 10% CO2;当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时,则应使用 5% CO2 培养细胞。

7. 何时须更换培养基?培养基中是否须添加抗生素?

视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上的更换时间,按时更换培养基即可。

除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。

8. 附着性细胞继代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53 mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 –20 ℃,避免反复冷冻解冻造成 trypsin 的活性降低,并可减少污染的机会。

9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部分含细胞的培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。

10. 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

欲回收动物细胞,其离心速率一般为 1 000 rpm,5~10 分钟,过高的转速,将造成细胞死亡。

11. 细胞的接种密度为何?

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。

12. 细胞冷冻培养基的成分为何?

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5~10% DMSO(dimethyl sulfoxide)和 90~95 % 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意:由于 DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将 DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。

13. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何?

冷冻保存使用的 DMSO 等级,必须为 Tissue culture grade 的 DMSO(如 Sigma D2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 4 ℃,避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO,则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。

14. 冷冻保存细胞的方法?欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

冷冻保存方法一:冷冻管置于 4 ℃ 30~60 分钟 →(-20 ℃ 30 分钟)→ -80 ℃ 16~18 小时(或隔夜)→ 液氮槽 vapor phase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中,存活率稍微降低一些。

冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。

15. 如何避免细胞污染?发生微生物污染时应如何处理?

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。

如果细胞发生微生物污染,加入相应抗生素,直接灭菌后丢弃。

16. 支原体(mycoplasma)污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?对细胞培养有何影响?

不能以肉眼观察出异状。除极有经验的专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨。

支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数,代谢及研究任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为 mycoplasma-free,实验结果的数据方有意义。

侦测出细胞株有支原体污染时,应直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。

17. 为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中,颜色会偏暗红色,且 pH 值会越来越偏碱性?

培养基保存于 4 ℃ 冰箱中,培养基内的 CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性,而培养基中的酸碱指示剂(通常为 phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤 CO2,以调整 pH 值。

18. 各种细胞培养用的 dish,flask 是否均相同?

不同厂牌的 dish 或 flask,其所 coating 的 polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大的影响,唯有少数细胞则可能因使用厂牌不同, dish 或 flask 有生长差异。

19. 购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因?细胞冷冻管解冻后,为何会有细胞数目太少的情形?

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳;血清使用错误或血清的品质不佳;解冻过程错误;冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心;悬浮细胞误认为死细胞;培养温度使用错误;细胞置于 –80 ℃ 太久。

研究人员在冷冻细胞培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

20. 收到的冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落的原因?

冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,是因热胀冷缩的物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

21. 如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之,首选 MEM 做粘附细胞培养,RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始,各种目的无血清培养最好首选 AIM V(12005)培养基(SFM)。

22. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

23. GlutaMAX-I 是什么?培养细胞如何利用 GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I 二肽是一个 L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常稳定,即使在 121 磅灭菌 20 分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

24. 什么培养基中可以省去加酚红?培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

25. 为什么目录上说 Hank's 平衡盐溶液(HBS)在空气中使用,不需要 CO2 培养箱?HBS 和 Earle's 平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS 和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在 Eagles(2.2 g/L)中比在 Hanks(0.35 g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡,以维持溶液的 PH 值。Eagles 液在空气水平的 CO2 中,溶液会变碱,Hanks 液在 CO2 培养箱中会变酸。如果希望在 CO2 培养箱中保存组织,需要用 Eagles 液,如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用 Hanks 液就可以了。

26. 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入 EDTA 的目的是什么?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用 EDTA 清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

27. 其他注意事项 当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

大部分添加物和试剂最多可以冻融 3 次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。

在溶解的一周内使用贮存在 4℃ 冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能开始降解,如果在室温下放置超过 30 分钟,就会变得不稳定。

为了保持 CO2 培养箱水盘清洁,需定期(至少每两周一次)用无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。

END

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本文转自公众号:生物学霸

编辑: 冯宁

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