上回说到如何进行蛋白质的样品制备、蛋白质定量及 SDS－PAGE 电泳，如果你还没看过，点此详见：《献给初学者：western blot 操作步骤详解》。下面就跟大家讲讲接下来的步骤。
转膜
我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90 kd 以下的蛋白，转膜液都不用加 SDS, 如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037% 的 SDS。
1. 在电泳结束前 20 min 开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备 6 张的滤纸（长一般为 8.1～8.3 cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁 8 cm 就行）和 1 张 PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min～2 min。目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2. 将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。也可取 10 ml 注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择，一是按照 marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸，平衡 10 min 左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
3. 带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放 3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜（此时可在 PVDF 右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外 3 张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。
用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。
由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做 western 的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。
4. 依据分子量大小电泳 15～60 min。如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少 kD 的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。
5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。传统方法是将膜用 1×丽春红染液染 5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入 20% 的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合 PVDF 膜）。将膜晾干备用。使用预染 marker 话可以看见 marker 的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。
免疫杂交反应
1. 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h 即可。如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜。
2. 将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用 TBST 稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的复方稀释液）至适当浓度（可以在 1.5 mlEP 管中配置工作液，常用稀释倍数为 1:200，1:500，1:1 000，具体需要预实验进行摸索，用后可回收重复用 2～3 次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。稀释后应在 2-3 天内使用，4 度保存，避免反复冻融。）
撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的折叠部分，用封口器（40～80 元一个）封上，不漏液即可）。37° 孵育 1 h 之后转移到室温下再孵育 1 h（或者 4°孵育过夜），用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min。也可以多洗几次，比如 4 次，每次 5 min。
3. 在培养皿内加入二抗稀释液（10 ml 足够了，一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀释），放在摇床上，室温下孵育 1～2 h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10 min；再用 TBS 洗一次，10 min, 进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。
化学发光（ECL），显影，定影
1. 现在工作台上铺一张保鲜膜，将 PVDF 膜放在保鲜膜上。将 ECL 的 A 和 B 两种试剂在 EP 管内等体积混合（注意吸完 A 试剂后吸 B 试剂前要患枪头），然后均匀滴在 PVDF 膜的蛋白面，反应 1～2 min 后，将 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干，之后转移到在 X 片夹中预先铺好的保鲜膜上一侧，把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。
2. 在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X-光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1 cm）；打开 X-光片夹，把 X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1 min 到 2 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果（也有人重叠压好几张片，固定曝光 5～10 分钟，从这好几张片中选出最合适的底片）；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为 1～2 min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10 min, 以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干（注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）。
X 光片一般选用柯达原装的生物实验专用柯达 X-OMATBT 胶片 . 显影液和定影液最好每周配置一次，避光室温保存，显影和定影液是最便宜的试剂了，千万不要因为它而影响了整个结果。
凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬请关注我们下一期内容。
主要参考资料
WB 实战指南+正确使用 Quantity One 定量 by jacqueslm2001
Abcam 的 western 新手指南
土豆网的 western blot 视频 上海交大出品
《分子克隆实验指南》精编版 化学工业出版社
《抗体技术实验指南》科学技术出版社
milipore 的 western blot 的优化方案
Western blot 步步看--网络流传最广的资料，作者不详
Bio-rad 蛋白印迹手册
穷人的劳斯莱斯-我的五年 western blot 体会
附：Western Blot Quick Guide 以及一天跑完 Western 的时间规划
1. 前期准备：蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和 SDS loading buffer 混合，已经分装好，保存与 -20°。头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入 4° 冰箱备用。
2. 8:00 从冰箱里取出蛋白样品，用 PCR 仪 95 度加热 5 min。混合均匀并离心。
3. 8:30 取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用 10 uL 的枪加样。
4. 9:00 开始电泳。恒流 30 mA 一般 1 个小时足够了。
5. 9:30 开始准备转膜用的滤纸和 PVDF 膜，PVDF 膜泡甲醇。一般 8 cm 的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。
6. 10:10 电泳结束（假设电泳用了 70 min），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。
7. 11:00 转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用 30 ～ 50 min，所以这里要抓紧时间）。
8. 12:00 转膜结束（这里按 60 min 的半干转的时间来计算）。开始封闭 1 h。
9. 13:00 封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择 37° 1 h 然后在室温（23°左右）再 1 h。
10. 15:00 一抗孵育结束。TBST 洗涤 3*10 min 或者 5*6 min。
11. 15:30 开始孵育二抗。室温 1 h 足够了。
12. 16:30 二抗孵育结束。TBST 洗涤 3*10 min 或者 5*6 min，这里推荐采用 5*6 min。
13. 17:00 ECL 发光，压片 10 min，显影 1 min，定影 10 min，那么在 18:00 之前你就能看到结果。如果结果不好还有后招，用 stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般 20 min 就行，然后洗涤几次，重新封闭 1 h，然后一抗过夜，明日再继续战斗。这样的话 18:30 之前也能结束战斗。
文章来源：丁香园站友 @dlzhangyu